生物发酵菊叶薯蓣富集薯蓣皂苷的研究

崔乃菠，马境谦，余河水，3，李正，2，3，何永志，3，别松涛，3*（. 天津中医药大学 中药制药工程学院，天津 3067；2. 组分中药国家重点实验室，天津 3067；3. 中药制药工程市级实验教学示范中心，天津 3067）

菊叶薯蓣（

Dioscorea composita

Hemsl.）为薯蓣科薯蓣属植物，是甾体激素药物的重要来源。薯蓣皂苷主要存在于菊叶薯蓣的根和块茎中，具有抗炎、抗真菌、抗纤维化、免疫调节等多种生物活性，对肝脏、心血管系统等多器官系统具有保护作用。研究发现，菊叶薯蓣中的甾体皂苷类成分经微生物发酵后会发生转化，产生次级皂苷及薯蓣皂苷元。在此过程中，不仅原有成分的含量会发生改变，还可能会产生新的物质，药效成分含量提高，药物活性增强。响应面分析法（RSA）是目前常用的多元统计技术，其与中心组合设计（CCD）结合可广泛应用于参数较少但参数间存在交互作用的参数条件的优化，改善了传统技术的不足，节省时间、试剂与材料，降低实验成本。目前，此方法已逐渐应用于优化中药有效成分的提取。

2020年版《中国药典》未收录菊叶薯蓣，也未见生物富集菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的报道，本研究以高效液相色谱法测得的菊叶薯蓣中的薯蓣皂苷含量为考察指标，采用单因素实验考察发酵时间、发酵温度、接种量对发酵过程中薯蓣皂苷含量的影响。在此基础上，采用响应面分析法进一步优化发酵条件，富集薯蓣皂苷，为菊叶薯蓣的深入开发与综合利用提供依据。

1 材料

1.1 试药

菊叶薯蓣药材，采自云南省会泽县，经天津中医药大学中药鉴定教研室张丽娟教授鉴定为薯蓣科薯蓣属植物菊叶薯蓣的干燥根茎；活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；马铃薯葡萄糖肉汤（PDB北京索莱宝科技有限公司）；薯蓣皂苷对照品（批号：Y20A10Z95575，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；乙醇（色谱纯，天津风船化学试剂科技有限公司）；水为超纯水。

1.2 仪器

Waters e2695HPLC色谱系统（四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱和Empower 色谱工作站，配有2424蒸发光散射检测器，美国活特世）；SB-5200DTD型数控超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CP1003电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；AB135-S电子分析天平（Mettler Toledo）；中草药粉碎机（天津市泰斯仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水处理系统（美国 Millipore 公司）；恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；台式高速冷冻离心机H1650R（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海云泰仪器仪表有限公司）。

2 方法与结果

2.1 菊叶薯蓣预处理

将干燥的菊叶薯蓣药材粉碎后过40目筛，称取2.0 g药材粉末和50 mL蒸馏水于150 mL锥形瓶中，混匀，121℃高压灭菌30 min。将一定接种量的酵母种子液加入菊叶薯蓣溶液中，恒温培养一定时间后，取出发酵液，过滤；精密称取1.0 g发酵固体，加70%乙醇超声提取30 min（功率360 W，频率40 kHz），补足失重，过0.22 μm微孔滤膜，续滤液为菊叶薯蓣发酵产物。

2.2 酵母种子液的制备

在250 mL锥形瓶中配制150 mL PDB培养基，121℃高压蒸汽灭菌30 min，将1.5 g活性干酵母接种至培养基中。30℃、150 r·min恒温振荡培养22 h，得到酵母种子液。

2.3 检测方式与评价依据

根据文献采用HPLC-ELSD法测定发酵前后菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的含量。

2.4 色谱条件

色谱柱为Symmetry C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B）溶液，梯度洗脱（0～5 min，25%～30%A；5～6 min，30%～31%A；6～10 min，31%A；10～20 min，31%～60%A；20～30 min，60%～95%A；30～32 min，95%A；32～35 min，95%～25%A）；体积流量1.0 mL·min，柱温30℃，蒸发光散射检测器参数：漂移管温度70℃，气体流速2.8 L·min。

2.5 薯蓣皂苷的含量测定

精密称取适量薯蓣皂苷对照品，用70%乙醇溶解，定容至10 mL量瓶中，配得薯蓣皂苷对照品质量浓度为 1.024 mg·mL，用70%乙醇分别稀释成系列浓度对照品溶液，进样测定，记录色谱峰面积，以对照品质量浓度的对数值为横坐标（

X

），峰面积的对数值为纵坐标（

Y

），绘制标准曲线，得到线性回归方程：

y

＝1.734

x

＋5.855，

R

＝0.9992，薯蓣皂苷在0.0683～1.024 mg·mL内与峰面积线性关系良好。薯蓣皂苷对照品的色谱图见图1。

图1 菊叶薯蓣对照品的HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of dioscin standard

2.6 单因素实验

根据预实验，以薯蓣皂苷峰面积为评价指标，考察酵母菌的接种量（5%、10%、15%、20%、25%），发酵时间（24、36、48、60、72 h），发酵温度（20、28、36、44、52℃）对发酵过程中薯蓣皂苷含量的影响。

2.6.1 接种量对薯蓣皂苷含量的影响 由图2A可知接种量是影响发酵后菊叶薯蓣中薯蓣皂苷含量的一个重要因素。在5%～15%时，随着接种量的增加，薯蓣皂苷的含量明显增加，原因是接种量的增加明显提高了发酵液中酵母菌的含量，提高了发酵效率；当接种量高于15%时，薯蓣皂苷的含量随接种量的增加而减小，可能是因为培养基中酵母菌数量过多，产生竞争性抑制，影响菌体生长代谢，减弱了发酵效果；同时会消耗部分指标成分用于菌种繁殖，降低其含量。故最适接种量的选择为15%。

2.6.2 发酵时间对薯蓣皂苷含量的影响 由图2B可知在24～48 h内，薯蓣皂苷的含量随发酵时间的延长而增加。但超过48 h，薯蓣皂苷的含量随着发酵时间的增加呈下降趋势。这种现象产生的可能是在发酵初期，培养基中营养物质充足，酵母菌代谢旺盛，有利于向薯蓣皂苷的转化，使其含量增加；时间过长，培养基中的营养物质不断被消耗，酵母菌代谢减慢，薯蓣皂苷含量降低，或是薯蓣皂苷在皂苷水解酶作用下生成皂苷元或次皂苷，使薯蓣皂苷含量减少。所以选择最适发酵时间为48 h。

2.6.3 发酵温度对薯蓣皂苷含量的影响 由图2C可知在20～36℃内，薯蓣皂苷的含量随发酵温度的升高而增加。当温度继续升高，薯蓣皂苷的含量随之下降。原因可能是温度影响了酵母菌的酶促反应。温度过低时，酶活性受到抑制；温度过高则使酶失活。温度为36℃时，酵母菌代谢旺盛，薯蓣皂苷含量最多，所以选择最适发酵温度为36℃。

图2 接种量（A）、发酵时间（B）及发酵温度（C）对薯蓣皂苷含量的影响Fig 2 Effect of inoculum concentration（A），fermentation time（B），fermentation temperature（C）on dioscin content

2.7 响应面分析实验

在单因素实验的基础上，根据中心组合设计原理，以菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的含量为评价指标，以发酵时间、发酵温度、接种量为自变量，设计三因素三水平响应面分析实验，因素水平见表1。

表1 响应面因素及水平
Tab 1 Factor and level of response surface analysis

水平 因素A.发酵时间/h B.发酵温度/℃ C.接种量/%－1 36 28 10 0 48 36 15 1 60 44 20

2.7.1 数学模型的建立及方差分析 在单因素实验的基础上，以薯蓣皂苷的含量（Y）为响应值，发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）为自变量，采用中心组合设计法进一步优化发酵条件，实验设计方案及结果见表2。

根据表2数据，采用Design Expert 8.0.6.1软件对其进行多元回归拟合，

A

、

B

、

C

为自变量，

Y

为响应值进行多元二次回归拟合，得到二次回归方程：

表2 响应面分析实验设计方案与结果
Tab 2 Design and result of response surface analysis

序号 A. 发酵时间/h B. 发酵温度/℃C. 接种量/%薯蓣皂苷含量/（mg·g－1）1 68.18 36.00 15.00 7.21 2 27.82 36.00 15.00 8.45 3 48.00 36.00 15.00 9.82 4 36.00 28.00 20.00 7.23 5 60.00 28.00 10.00 7.81 6 60.00 44.00 20.00 7.06 7 48.00 49.45 15.00 5.97 8 48.00 36.00 15.00 8.92 9 48.00 36.00 15.00 10.05 10 36.00 44.00 10.00 4.11 11 48.00 36.00 23.41 7.69 12 60.00 44.00 10.00 4.02 13 48.00 36.00 15.00 9.73 14 48.00 36.00 6.59 5.01 15 48.00 36.00 15.00 9.56 16 36.00 28.00 10.00 7.54 17 60.00 28.00 20.00 8.12 18 48.00 36.00 15.00 9.26 19 48.00 22.55 15.00 8.64 20 36.00 44.00 20.00 8.78

Y

＝9.56－0.20

A

－0.82

B

＋0.89

C

－0.37

AB

－0.13

AC

＋0.96

BC

－0.65

A

－0.83

B

－1.17

C

方差分析结果见表3。该模型差异高度显著（

P

＜0.0001），薯蓣皂苷含量失拟项

P

＝0.3807＞0.05，失拟不显著；决定系数

R

＝0.9685、校正决定系数

R

＝0.9401，表明薯蓣皂苷含量的真实值与预测值拟合程度较高，误差小；模型变异系数为5.70%（＜10%），说明模型精确度较高。接种量对薯蓣皂苷的含量影响最大，发酵温度次之，发酵时间影响最小。对回归模型显著性分析可知：模型的一次项

B

、

C

，二次项及交互项

BC

，为薯蓣皂苷含量极显著影响因素（

P

＜0.01）；交互项

AB

为薯蓣皂苷含量的影响显著因素（

P

＜0.05）；一次项

A

、交互项

AC

对薯蓣皂苷含量影响不显著。

表3 回归模型方差分析
Tab 3 Regression model analysis of variance

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 59.88 9 6.65 34.14 ＜0.0001 A 0.55 1 0.55 2.81 0.1245 B 9.22 1 9.22 47.30 ＜0.0001 C 10.93 1 10.93 56.08 ＜0.0001 AB 1.10 1 1.10 5.66 0.0387 AC 0.13 1 0.13 0.65 0.4374 BC 7.43 1 7.43 38.12 0.0001 A2 6.07 1 6.07 31.14 0.0002 B2 10.04 1 10.04 51.51 ＜0.0001 C2 19.80 1 19.80 101.61 ＜0.0001残差 1.95 10 0.19失拟项 1.11 5 0.22 1.33 0.3807纯误差 0.84 5 0.17总和 61.83 19

2.7.2 响应面分析 绘制响应面图及等高线图，见图3。两因素之间交互作用的强弱可以通过等高线的形状判断，圆形表示因素间交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。通过等高线图可以看出发酵时间与发酵温度之间交互作用显著，随着发酵时间和发酵温度的提升，薯蓣皂苷的含量先增加后减少；发酵温度与接种量交互作用显著，薯蓣皂苷的含量随发酵温度和接种量的升高呈先增加后减少的趋势；发酵时间、接种量交互作用不显著，随着发酵时间和接种量的增加，薯蓣皂苷的含量开始增加，但当两者增加到一定量后薯蓣皂苷的含量开始下降。

图3 各因素交互作用对薯蓣皂苷含量影响的响应面及等高线图Fig 3 Response surface plots and contours of effect of different factors on dioscin content

2.7.3 验证富集薯蓣皂苷的最佳发酵条件 通过对响应面结果分析，结合 Design Expert 8.0.6.1软件得到富集薯蓣皂苷的最佳发酵条件为：发酵时间为46.98 h，发酵温度33.38℃，接种量16.28%，在此条件下薯蓣皂苷含量的预计值为9.81 mg·g。结合实验可操作性，调整发酵条件为：发酵时间47 h，发酵温度33.4℃，接种量16.3%。平行操作3次，薯蓣皂苷含量的实际值为9.38 mg·g，与预测值差异不显著，说明此方程可以较准确地模拟各因素对发酵过程中薯蓣皂苷含量的影响，优化富集薯蓣皂苷的发酵条件。

3 讨论与结论

薯蓣皂苷具有多种药理活性，可用于消肿祛毒、舒筋通络止痛、助消化等，主要以与纤维素结合的形式存在于植物细胞壁中。传统的提取方法是用石油醚或者丙酮等有机溶剂直接溶解，产率低且易造成污染。与传统方法相比，利用微生物发酵富集目标成分不需要添加额外的催化剂，具有毒副产物少、反应条件温和、过程简单、生物利用率高等优点，已被广泛应用于中药的开发与利用。本实验以菊叶薯蓣中薯蓣皂苷的含量为评价指标，单因素实验考察发酵时间、发酵温度、接种量对薯蓣皂苷含量的影响，采用响应面分析法进一步优化薯蓣皂苷的发酵条件，建立二次回归方程模型。结果表明，接种量对薯蓣皂苷的含量影响最大，发酵温度次之，发酵时间影响最小。在优化后的最佳发酵条件（温度33.4℃，时间47 h，接种量16.3%）下，测得薯蓣皂苷含量实际值与预测值相差不大，证明该方程拟合度高，准确性好，可行性高，可为富集薯蓣皂苷的发酵工艺提供参考。

酵母菌属于真核微生物，适应性强、繁殖周期短、代谢途径简单、易于培养，广泛应用于食品、化工、制药等领域，并且有研究表明酵母菌已被用于微生物转化皂苷成分。利用酵母菌发酵可以富集薯蓣皂苷，可能是因为酵母菌发酵过程中生物酶的产生，破坏了细胞壁，有利于薯蓣皂苷在提取介质中的扩散。菊叶薯蓣中原薯蓣皂苷含量较高且水溶性良好，薯蓣皂苷含量的增加也可能是因为发酵过程中呋甾皂苷状态的原薯蓣皂苷发生水解，生成苷元母核相同的F-环环合螺甾皂苷薯蓣皂苷（见图6）。

图6 原薯蓣皂苷转化成薯蓣皂苷的途径Fig 6 Transformation of protodioscin into dioscin