血小板聚集分析仪LBY-NJ4A 与Chrono-log700性能比较*

李 勤,凌莉琴,刘超男,陈 思,周 静

四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041

血小板功能检测广泛应用于临床出血性疾病的诊断以及抗血小板药物的治疗监测[1-3]。光透射血小板聚集检测(LTA)被认为是评价血小板聚集功能的“金标准”[4],其检测原理是富血小板血浆(PRP)标本在诱导剂作用下发生血小板聚集,使血浆浊度降低,透光度增加,仪器将光信号转变为电信号经过放大和信号处理后,得到各个时间点的聚集率以及全检测过程的聚集曲线。

血小板聚集率结果的可信度受采血、分离、诱导剂效价和比色等环节的分析前质量控制和标准化操作影响。传统LTA 操作步骤多,影响因素较多,结果重复性较低。因此,血小板聚集功能检测仪器的自动化需求越来越大。目前,厂商研制出了一种新型的全自动血小板聚集分析仪LBY-NJ4A,可满足大样本量检测,但投入临床应用的时间尚短,相关研究较少,其应用价值仍有待进一步评估[5]。因此,本文根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)的仪器性能评价方法[6]及美国临床实验室修正法规(CLIA'88)的评价方法[7],评价并比较LBY-NJ4A 与实验室常用的手动仪器Chrono-log700的主要性能指标,并对厂家提供的参考范围进行验证,为今后血小板聚集仪的临床应用提供研究基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取试验当天本院收治的住院患者80例为研究对象。其中血小板最大聚集率(MAR)大于参考范围上限(高聚集率组)40例(急性脑梗死20例,急性冠脉综合征20例);MAR 小于参考范围下限(低聚集率组)40例(抗血小板药物治疗20例,肝硬化20例)。同时选取体检健康者40例,其中男20例,女20例,肝、肾、内分泌功能以及血常规、凝血功能指标等均在正常范围内,采血前2周内未服用任何影响血小板功能的药物。

1.2 仪器与试剂 血小板聚集分析仪(Chronolog700,美国;LBY-NJ4A,中国);全自动血细胞分析仪(SysmexXN-9000,日本);以终浓度5 μmol/L腺苷二磷酸(ADP)、500 μg/mL 花生四烯酸(AA)、4 μg/mL 胶原(COL)为诱导剂,3种诱导剂均购于泰利信医疗科技有限公司。用LTA 方法测定5 min 内的MAR。

1.3 方法 所有血液标本均使用美国BD 公司生产的109 mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝真空采血管采集空腹血。全血标本以160×g离心10 min获得PRP,2 000×g离心10 min获得乏血小板血浆(PPP)。标本从开始采集到检测结束时间控制在3 h内。

1.3.1 批内精密度 选择患者两个水平的混合血浆标本,分别在两种仪器上检测ADP 最大聚集率(MARADP)、AA 最大聚集率(MARAA)和COL最大聚集率(MARCOL),连续检测10次,计算均值)、标准差(s)和变异系数(CV)。

1.3.2 日间精密度 使用厂家提供的两个水平的标准浊度物,分别在两种仪器上检测MARADP、MARAA和MARCOL,每天1 次,连续检测20 d,计算、和CV。

1.3.3 通道一致性 分别使用ADP、AA 和COL 3种诱导剂进行通道一致性评价。以ADP 为例,LBYNJ4A 4个不同通道 (Chrono-log700 两个不同通道)测定同一标本的MARADP,每个通道各检测5 次。LBY-NJ4A 4个不同通道的测定值使用单因素方差分析,Chrono-log700 两个不同通道的测定值使用配对样本t检验进行比较。此外,计算各通道均值),以通道1为标准通道,计算其余通道与通道1测定均值的相对偏差(RD)100%,i=2、3、4。

1.3.4 参考范围验证 以ADP、AA、COL 为诱导剂,两种仪器分别测定40 例体检健康者PRP的MAR。根据CLSI 颁布的EP28-A3C[6]文件,若40例健康体检者中落在参考范围外的测定值不超过4例(R≥90%,R=落在参考区间例数/实测例数×100%),认为该参考范围可以作为临床使用,否则应考虑重新建立适用的参考范围。

1.3.5 抗干扰能力 收集多个水平PRP 为基础样品,按不同比例混合分成5组。分别加入已知终浓度的生物性干扰物血红蛋白(Hb)、总胆红素(TBIL)和三酰甘油(TG)。测定并记录加入干扰物前后的标本MAR,计算干扰率(%)=(干扰物后检测结果-干扰物前检测结果)/干扰物前检测结果×100%。要求加入干扰物后的PRP 中血小板水平不低于100×109/L,以避免血小板水平过低对检测结果造成影响[8]。

1.3.6 仪器间相关性 分别以ADP、AA、COL为诱导剂,LBY-NJ4A 为检测仪器,Chrono-log700为对照仪器,对检测结果计算R、回归方程。

1.3.7 携带污染率 分别以ADP、AA、COL为诱导剂,在LBY-NJ4A 上用高值PRP和低值PRP两份标本进行连续测定3次,检测结果分别为H1、H2、H3、L1、L2、L3,并按公式计算携带污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 批内精密度 两种仪器测定的MARADP、MARAA和MARCOL批内精密度的CV为4.3%～4.9%,均符合CLSI EP5-A2文件推荐的小于5%的标准,见表1。

表1 批内精密度结果(%)

2.2 日间精密度 两种仪器测定MARADP、MARAA和MARCOL日间精密度的CV为3.5%～4.8%,符合CLSI EP5-A2标准,见表2。

表2 日间精密度结果(%)

2.3 通道一致性 两种仪器的通道一致性均符合CLIA'88的标准,即通道间测定值差异无统计学意义(P>0.05),通道间测定值RD≤1/2 总允许误差(10%),见表3。

表3 仪器各通道测定结果(%)

2.4 参考范围验证 以ADP、AA 和COL 为诱导剂,40例体检健康者在LBY-NJ4A 上的检测结果,全部在LBY-NJ4A 厂家提供的参考范围内;在Chronolog700上的检测结果,≥95%在Chrono-log700厂家提供的参考范围内。两种仪器的参考范围验证均符合CLSI EP28-A3C要求。见表4。

表4 MARADP、MARAA、MARCOL 参考范围验证(n=40)

2.5 抗干扰能力 终浓度为156 mg/L的Hb和3.7 g/L的TG 不影响两种仪器的检测结果(干扰率均小于厂家给定的批内变异率10%);终浓度为240 mg/L的TBIL不影响LBY-NJ4A 检测结果(5个标本检测干扰率<10%),但可影响Chrono-log700检测结果(3个标本检测干扰率>10%),见表5。

表5 干扰物对仪器检测MARADP的影响(%)

2.6 仪器间相关性 ADP、AA、COL 为诱导剂时,两仪器相关系数r分别为0.847、0.915 和0.929(P<0.05),仪器相关性好。

2.7 携带污染率 LBY-NJ4A 携带污染率符合厂家要求(≤5.00 %),见表6。

表6 LBY-NJ4A 携带污染率测定结果(%)

3 讨论

血小板具有黏附、聚集、释放等生理功能[9]。其聚集特性不仅在生理止血中发挥重要作用,也是病理血栓形成的首要因素之一[10-12]。血小板膜上存在ADP受体,当其与ADP 结合可使血小板发生聚集。ADP来源于血管损伤部位发生血小板黏附后的损伤组织及红细胞,但血小板释放的内源性ADP 是主要的血小板诱导剂[13-14]。除ADP 外,AA、COL 和瑞氏托霉素等也可使血小板发生聚集,并诱发血小板释放内源性ADP进一步促进聚集。目前,血小板聚集功能检测已成为常规检验项目,血小板聚集功能检测可对血栓性疾病和出血性疾病的诊断和治疗进行评估,还可以对抗血小板聚集药物的临床效果进行初步评估,具有很好的临床指导性。

LTA 至今被认为是世界范围内血小板聚集功能检查的“金标准”,传统LTA 操作步骤多,包括制备PRP和PPP标本、检测标本原始透光度、手动加入诱导剂、实时检测透光度变化等,因此标本检测周期较长,影响因素较多,结果不够稳定。为此,采用自动化仪器检测血小板聚集功能的临床需求越来越受到重视。

本研究对传统手工法Chrono-log700与自动化仪器LBY-NJ4A的检测性能进行了比较。由于血小板聚集功能检测的特殊性(体外血小板易被激活,不易保存及运输),本研究利用仪器间相关性分析,对Chrono-log700与LBY-NJ4A的检测结果相互验证正确度。结果表明Chrono-log700 与LBY-NJ4A的检测结果具有良好的相关性(r>0.8)。另外,两种仪器均具有良好的精密度、通道一致性和临床实用的参考范围区间。因此,两种仪器均满足血小板聚集功能检测的基本要求。

LTA 为比浊法,检测过程易受血浆中的一些具有光散射性物质如Hb、TG、TBIL 等的影响,造成检测结果不准确[15]。本研究结果表明终浓度为156 mg/L的Hb和3.7 g/L的TG 不影响两种仪器的检测结果,表明两种仪器对Hb及TG 抗干扰能力均较强;而终浓度为240 mg/L的TBIL 不影响LBYNJ4A 检测结果,但可影响Chrono-log700检测结果,表明LBY-NJ4A 抗TBIL 干扰能力优于Chronolog700。Chrono-log700检测过程为手工加样,不涉及管道系统和加样针,无携带污染率;而LBY-NJ4A 为自动化检测过程可避免人为误差,保证标准化操作,虽有一定的携带污染率(3.27%～4.17%),但也符合厂家要求(≤5.00%)。

综上所述,LBY-NJ4A 与Chrono-log700 均符合CLSI、CLIA'88及厂家的相关标准,可用于检测血小板聚集功能。但LBY-NJ4A 抗干扰能力更强,自动化程度较高,人工需求较少,因此LBY-NJ4A 将更有利于实验室大样本量工作的开展。