血清miR-296-5p及胃蛋白酶原mRNA 表达水平对胃癌诊断和预后评估的临床价值

白菊芳,许国彩,刘芝兰,薛晓红

青海省人民医院消化内科,青海西宁 810000

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤,也是全球癌症相关死亡的第三大原因。2018年,全球新发生胃癌约100万人,78.3万人死亡[1-2]。早期胃癌仅限于黏膜和黏膜下层,其症状与良性消化性溃疡无法鉴别。对这部分胃癌患者进行筛查可提高早期胃癌的检出率,从而提高其预后。微小RNA(miRNAs)是高度保守的、小的(长度为19～25个核苷酸)单链 RNA,其显著特征是不编码蛋白质[3]。研究表明,miRNAs 在多种肿瘤组织基因组中异常表达并在血液中保持稳定。此外,miRNAs参与各种生物学过程,如增殖、分化和转移。miRNAs 参与胃癌的发生和进展,这表明miRNAs可以作为诊断治疗胃癌的标志物[4-5]。miR-296-5p是一种多功能miRNA,在不同的癌症中具有不同的功能。miR-296-5p的致肿瘤作用已在前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、鼻咽癌和结直肠癌中得到证实[6-7]。胃蛋白酶原属于天冬氨酸蛋白酶家族,在病理条件下,胃蛋白酶原表达水平发生显著变化;在浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌的动态变化过程中,胃黏膜中胃蛋白酶原的原位表达明显升高,说明胃蛋白酶原是比较理想的诊断胃癌的标志物[8]。本研究拟探讨血清miR-296-5p及胃蛋白酶原mRNA 在胃癌诊断和预后评估中的临床价值,为胃癌的诊断治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年3月至2019年3月在本院经病理证实的胃癌患者198例为胃癌组,其中男102例,女96例;年龄47～74岁,平均(58.73±5.56岁)。选择198例胃部良性疾病患者为胃病组,其中胃溃疡95例,胃炎103例;男106例,女92例;年龄48～72岁,平均(58.21±5.73岁);选择同期198例健康体检者作为对照组,其中男105例,女93例;年龄49～75岁,平均(58.85±5.68)岁。所有患者术前均未接受过相关治疗。手术治疗切除癌组织后,标本固定在甲醇中进行病理分析。本研究已获得本院医学伦理机构审查委员会的批准,所有患者均签署知情同意书。根据美国癌症联合委员会(AJCC)分期对肿瘤进行分类。

1.2 方法

1.2.1 血清中miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平检测 采集所有研究对象静脉血标本5 mL,在4 ℃下以3 000×g离心15 min,将上清液转移到1.5 mL无RNase管中,并在-80 ℃下储存待用。

使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,批号:CV-5986.69)从血清中提取总RNA,并用 DNase I(Promega,Madison,WI,批号:BC-74856.69)消化基因组DNA。使用 ImProm-ⅡTM逆转录系统(Promega,DC-56963.63)逆转录11 g RNA 为cDNA,逆转录条件为42 ℃ 60 min,85 ℃ 10 min。使用SYBR GREEN qPCR Super Mix(Invitrogen)和Applied Biosystems 7500系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行RT-PCR,条件如下:95 ℃变性10 min,95 ℃ 15 s,65 ℃ 32 s,40个循环。miR-296-5p、胃蛋白酶原、GAPDH 引物由武汉金开瑞生物科技公司合成。引物序列如下:miR-296-5p 正向,5'-TCA CGT AGC TAG CTA GCT AGC TGA TCG ATC GAT GCT AG-3';反向5'-TGC GAT CGA TCG TAG CTA GTC GAT GCT AGC TAG CTA GTG-3'。胃蛋白酶原正向,5'-TGT GTA GTC GAT CGT AGC TAG CTG ATC GAT GCT AGC TAG CTC G-3';反向5'-TGT GTC GTA GCT AGT CGA TGC TAG GAT GCT AGT CGA TCG ATG CT-3,;GAPDH 正向,5'-TGT GCT GAT GCT AGC TAG TCG ATC GAT GCT AGC TAG TCG ATG CAG T-3';反向5'-TGT GCA TGC TAG CTA GTC GAT GCT AGT GTG ATG CGA GTC GAT GTC-3'。使用改良2-ΔΔCt方法计算miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA的相对表达水平,并以GAPDH 作为内参进行归一化。

1.2.2 随访 随访方式为电话随访,内容主要为术后生活质量,随访开始日期为出院日期,结束日期为2021年5月1日。

1.3 统计学处理 采用SPSS23.0对数据进行统计学分析。正态分布的计量资料采用表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;非正态分布的计量资料采用M(P25,P75)表示,组间比较采用秩和检验。计数资料采用百分数表示,组间比较采用χ2检验;采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平对胃癌的诊断价值;以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平比较 胃癌组和胃病组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平高于对照组(P<0.05);胃癌组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平高于胃病组(P<0.05)。见表1。

表1 3组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平比较()

表1 3组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与胃病组比较,bP<0.05。

2.2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平与临床病理特征的关系 以胃癌组miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 均值4.14、6.99为界值,≤4.14、≤6.99分别为miR-296-5p低表达组、胃蛋白酶原mRNA 水平低表达组;>4.14、>6.99分别为miR-296-5p高表达组、胃蛋白酶原mRNA 水平高表达组。

结果显示,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平与性别、年龄无关(P>0.05);与肿瘤最大径、TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移和复发有关,且肿瘤最大径≥5 cm、TNM 分期越高、浸润深度越深、有淋巴结转移、有复发的胃癌患者其miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 高表达率越高(P<0.05)。见表2。

表2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平与胃癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 不同miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平的胃癌患者预后比较 所有胃癌患者自出院后至随访结束存活时间4～60 个月,5 年生存率为45.4%(90/198)。miR-296-5p 高表达组、胃蛋白酶原mRNA 高表达组5 年生存率及生存期明显低于miR-296-5p和胃蛋白酶原mRNA 低表达组(P<0.05)。见表3。

表3 不同miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平的胃癌患者预后比较

2.4 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 诊断胃癌的临床价值 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 联合检测诊断胃癌的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度、准确度均高于miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 单独检测(P<0.05);见表4。

表4 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 诊断胃癌的临床价值分析

续表2 miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平与胃癌临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨论

癌症在分子水平上表现出显著的复杂性,与多个基因、蛋白质、通路和调节相互关联。近年来,多项研究表明miRNAs可能是包括胃癌在内的多种癌症诊断和预后的生物标志物[4-5]。据报道,miR-1236-3p的表达在胃癌组织中明显降低,这表明该miRNA 可以作为胃癌的诊断和预后生物标志物;胃癌患者血清miR-25水平明显上调,因此,miR-25可用作胃癌诊断和预后的标志物[6]。miR-296-5p是miR-296家族成员,在恶性肿瘤中高表达并作为经典的癌基因参与癌变[7-8]。既往研究报告了循环miR-296-5p 在恶性肿瘤中的表达水平上调,如非小细胞肺癌(NSCLC),以及宫颈癌、肝癌、结直肠癌和前列腺癌[9]。DONG等[10]通过筛选恶性肿瘤患者的循环miRNA 表达谱鉴定了5种血清miRNA(miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34和miR-296-5p)在肝癌诊断中具有潜力。同时,有研究者报道,血清miRNA 诊断乳腺癌的AUC明显高于经典生物标志物,如癌胚抗原(0.503)和糖类抗原19-9(0.600)[11]。研究报道,miR-296-5p可能通过靶向调节核因子(NF)-κB 抑制剂来促进NF-κB信号通路和下游靶标livin和survivin的激活进而参与肝癌的进展[12]。miR-296-5p在多种癌症中起着至关重要的作用[13];miR-296-5p 促进了胶质母细胞瘤细胞的侵袭,并表明miR-296-5p可能是胶质母细胞瘤的治疗靶标;与正常肠黏膜相比,miR-296-5p表达水平在结直肠癌组织中明显升高[14]。已有研究证明,miR-296-5p在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,miR-296-5p是影响结直肠癌患者5年生存期的独立预后因素[15]。

本研究结果显示,胃癌组miR-296-5p 表达水平高于胃病组与对照组(P<0.05);miR-296-5p与胃癌患者肿瘤最大径、TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移和复发有关,且肿瘤最大径≥5 cm、TNM 分期越高、浸润深度越深、有淋巴结转移、有复发,miR-296-5p高表达率越高(P<0.05)。miR-296-5p高表达组胃癌患者5年生存率及生存期明显低于miR-296-5p低表达组(P<0.05)。这说明胃癌患者血清miR-296-5p表达水平升高,miR-296-5p 与胃癌患者临床病理特征、预后有关。

胃蛋白酶原是胃细胞成熟的标志物,其变化可反映胃部病变程度。研究发现,胃蛋白酶原抗原在不同胃病中表达水平不同,胃蛋白酶原在正常胃黏膜中的高表达率为15.0%,在胃癌中为65.9%;在不同疾病中,胃蛋白酶原高表达率从低到高依次为良性病变、癌前病变和胃癌[16]。临床流行病学研究发现,血清胃蛋白酶原异常的成年居民具有更高的胃黏膜癌前病变(肠上皮化生和上皮异常增生)发生风险[17]。本研究发现,胃癌患者血清胃蛋白酶原mRNA 表达水平升高,胃蛋白酶原mRNA 表达水平与胃癌患者临床病理特征、预后有关,这与上述研究结论一致。

血清胃蛋白酶原可以反映胃黏膜的组织学状况,对胃癌具有潜在的诊断价值。有研究显示,miR-92a与胃蛋白酶原联合检测对胃癌诊断的灵敏度和特异度分别为86.49%和89.32%[18]。本研究中,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 联合检测诊断胃癌的灵敏度、特异度、准确度、AUC均高于miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 单独检测(P<0.05)。这说明,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 联合检测筛查胃癌具有较高的灵敏度、特异度,可在临床上应用。

综上所述,胃癌患者血清miR-296-5p 及胃蛋白酶原mRNA 表达水平升高,miR-296-5p、胃蛋白酶原mRNA 表达水平与胃癌患者临床病理特征、预后有关;miR-296-5p、胃蛋白酶原联合检检测诊断胃癌具有较高的灵敏度、特异度,可在临床上推广应用。