lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a生物轴在HBV感染相关疾病中的表达及临床意义*

乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝硬化和肝癌的独立危险因素之一

。最近有研究显示，HBV可以触发自噬途径，通过该途径病毒可以被激活以促进HBV DNA复制

，因此在HBV感染中，早期自噬有利于HBV复制。而当疾病进展为肝癌时，激活的自噬可通过细胞自噬性死亡程序和抗肿瘤免疫反应来延缓肿瘤进展

。因此，自噬有望成为病毒感染及其相关疾病的一个重要而新颖的靶点。由于其在许多生物过程中的重要作用，非编码RNA(ncRNAs)越来越受到关注。然而微小RNA(miRNAs)并不独立参与生理和病理过程。相反，长非编码RNA(lncRNAs)通过miRNAs最终调节靶mRNA水平。生物信息学数据预测发现，lncRNA核富集转录本1(NEAT1)含有miR-29b的靶位点，miR-29b同样含有自噬相关基因9a(ATG-9a)的互补序列。有研究显示miR-29b在HBV感染相关疾病中呈低表达

，然而，NEAT1是否在HBV感染中调节miR-29b进而影响自噬过程尚不清楚。本研究拟检测HBV感染相关肝脏疾病患者血清NEAT1、miR-29b以及ATG-9a蛋白表达差异，为深入认识HBV感染性疾病的进展机制提供一定的临床证据支持。

(3)L1层各弧段的距离误差完成后,可选取最小距离误差及其匹配弧段继续分段构成L2层搜索弧段,但事实上最优解并不一定位于最小距离误差弧段的内部,而是可能落于两相邻弧段中点所限定的区域的任意位置(图3左侧高度弧实线所夹区域);对于边缘弧段则是弧线端点与相邻弧段中点所限定的区域(图3右侧)。故为避免遗漏最优解,在此保留该区域,将其等分为2N份(边缘区域分为1.5N份)构成L2层搜索弧段,并删除剩余区域以大幅减少运算量,重复步骤(2)搜索最小误差弧段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究共纳入我院2018年1月至2020年3月收治的120例初次确诊的HBV相关肝脏疾病患者。所有患者均为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性和/或HBV DNA阳性6个月以上者，包括42例慢性乙型肝炎(CHB)、38例肝硬化(Cirr)、40例肝细胞癌(HCC)。诊断符合相关学会制定的诊断标准

。另外采集30例健康志愿者的血液样本作为对照。4组受试者临床资料见表1。排除标准：①与人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染的患者；②丙型肝炎病毒(HCV)感染、药物摄入、饮酒和自身免疫性肝炎等原因引起的肝损伤患者；③患有严重系统性疾病者；④妊娠或哺乳人群。所有参与研究的患者均获得书面知情同意书。整个研究根据《赫尔辛基宣言》进行，并得到我院伦理委员会的批准。

1.2 观察指标 测定各组受试者肝功能指标，包括总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)；PL

=血小板/淋巴细胞计数；NL

=中性粒细胞计数/淋巴细胞计数；检测HBsAg滴度。采用荧光定量PCR方法检测lncRNA NEAT1和miR-29b的相对表达量。测定各组受试者血清ATG-9a水平。

1.3 双荧光素酶报告基因分析 合成含有miR-29b结合位点的ATG-9a基因野生型3'UTR序列(ATG-9a WT)和突变体ATG-9a序列(ATG-9a MUT)，并克隆到pmirGLO载体(美国Promega公司)中。将HEK293T细胞培养在24孔板中，然后转染pmirGLO-ATG9a WT或pmirGLO-ATG9a MUT，然后用LipoFiter 3.0TM将50 nmol/L miR-29b模拟物或模拟NC共转染至细胞中。使用双荧光素酶报告分析系统(美国Promega公司)测量相对荧光素酶活性。另外，由Sangon生物技术公司合成含有miR-29b结合位点的NEAT1野生型序列(NEAT1 WT)和该序列的突变体(NEAT1 MUT)，并将其插入pmirGLO载体，分析lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a靶向调控关系。

2.4 3组患者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平与HBV DNA病毒载量的关系 CHB组、Cirr组、HCC组患者HBV DNA病毒载量分别为(2.24±1.34)copies/ml、(3.52±1.65)copies/ml、(3.53±2.12)copies/ml，Cirr组、HCC组患者HBV DNA病毒载量高于CHB组，差异有统计学意义(

<0.05)；而Cirr组和HCC组患者HBV DNA病毒载量比较差异无统计学意义(

>0.05)。经Pearson法分析，CHB组、Cirr组、HCC组患者血清lncRNA NEAT1、ATG-9a水平与HBV DNA病毒载量呈正相关性(

=0.798，0.834，均

<0.001)；而血清miR-29b相对表达量与HBV DNA病毒载量呈负相关性(

=-0.733，

<0.001)，见图3。

2 结果

2.5 3组患者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平与PLR、NLR的关系 经Pearson法分析，CHB组、Cirr组、HCC组患者血清lncRNA NEAT1、ATG-9a水平与PLR(

=0.464，0.512，均

<0.001)和NLR(

=0.646，0.705，均

<0.001)呈正相关性；而血清miR-29b相对表达量与PLR(

=-0.481，

<0.001)和NLR(

=-0.608，

<0.001)呈负相关性，见图4。

分类器是一种利用已知的观察数据（测试数据或实验数据）构建的分类模型，并以此来预测未知类别的对象所属类别。常见的基分类器包括线性回归，决策树，基于关联规则的分类，贝叶斯信念网络，向后传播，支持向量机（SVM）等方法，其中包括ID3及其改进算法C4.5，分类回归树CART，基于频繁模式的CBA、CMAR、CPAR 等算法[8，9]。

2.3 双荧光素酶基因报告分析lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a靶向调控关系 为了揭示lncRNA NEAT1和miR-29b对自噬的调控作用，利用TargetScan (http://www.targetscan.org)和StarBase (https://starbase.sysu.edu.cn/targetSite.php)预测，确定ATG-9a是miR-29b的靶标，而且NEAT1也存在与miR-29b互补序列。为了证实这一预测，我们利用HEK293细胞进行了荧光报告分析。结果表明，miR-29b mimics降低了ATG-9a-3’UTR-WT的荧光强度，而对ATG-9a-3’UTR-MUT没有显著影响。同样miR-29b mimics降低了NEAT1-3’UTR-WT的荧光素酶活性，见图2。

基于以上讨论，本文重点考虑抗滑桩受荷段底端的土拱跨中前缘M点的三向应力状态。其中，M点水平面内的应力为σx和σy，σx为桩后土拱拱顶处的轴向压应力，σy为桩侧土拱对桩后土拱的反力，竖向应力σz可由受荷段底端的土体自重应力算出，因此，M点三向应力表达式为：

2.2 3组患者血清miR-296与lncRA NEAT1和ATG-9a水平的关系 经Pearson法分析，CHB组、Cirr组、HCC组患者血清lncRNA NEAT1与miR-29b相对表达量呈负相关性(

=-0.755，

<0.001)，miR-29b与ATG-9a相对表达量呈负相关性(

=-0.835，

<0.001)见图1。

2.1 4组受试者血清lncRA NEAT1、miR-29b、ATG-9a水平检测结果 见表2。

3 讨论

自噬是真核细胞体内一种进化上高度保守的膜系统，它能吞噬长寿命的蛋白质和受损的细胞器并保持细胞内的稳态

。自噬的进展始于自噬相关基因(ATG)的激活，在Beclin-1(BECN1)-Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)复合物和轻链3(LC3)脂肪酶作用下形成具有双层膜结构的自噬小体，通过与溶酶体对接和融合来完成自噬过程

。自噬诱导或激活的关键过程是形成完整的双膜结构，该结构可吞噬有故障的蛋白质或细胞器，并随后通过与溶酶体融合将其降解

。在关键的自噬相关蛋白质中，ATG-9a在自噬体的组装和随后的自噬激活中起着关键作用

。研究表明，ATG-9a基因缺陷会影响自噬过程的启动，并影响HBV病毒复制过程

。也有报道称，HBV在体内外均可诱导自噬

。在本研究中，随着HBV DNA病毒载量增加，HBV感染相关肝脏疾病患者血清ATG-9a蛋白水平也相应增加，提示早期自噬有利于HBV的复制，从而加重肝脏感染程度。自噬在HBV正常生命周期中发挥着重要作用，如HBV包膜，已逐渐被很多研究所证实

。HBV可以触发自噬途径，通过自噬途径，病毒可被激活以促进其DNA复制。

HBV是一种具有高传染性、严格的嗜肝性DNA病毒，现有治疗药物的耐药性和副作用不容忽视

。本研究结果提示，lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a轴与HBV DNA病毒载量以及系统炎症指标PLR、NLR密切相关。随着HBV感染相关肝脏疾病的进展，自噬过程被激活，而且HBV可利用自噬系统的元素进行病毒复制。

The general form of surface potential ψsλ(y) in GSGCDMT-SON MOSFET can be obtained by solving the second order differential equation given in Eq. (11). Its solution is given as

然而，HCC与HBV诱导的自噬关系更加复杂。当疾病进展为肝癌时，激活的自噬可通过自噬细胞死亡和抗肿瘤免疫反应来减弱肿瘤进展。在HBV转基因肝肿瘤小鼠模型和人类HBV诱导的HCC标本中ATG表达有所下调

；而且在BECLIN1-/-模型小鼠中，HCC进程加快

。上述数据表明在肝细胞癌变早期，细胞自噬处于较低水平，因此在本研究中，虽然HCC患者PLR、NLR等系统性炎症指标较CHB和Cirr患者进一步升高，但是HBV-HCC患者血清lncRNA NEAT1、miR-29b、ATG-9a相对表达量与HBV-Cirr患者相比差异均无统计学意义。

miRNAs通过靶向编码mRNAs的3'-UTR诱导mRNA降解或抑制mRNA翻译。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，它们都有相同的种子区，在肝脏疾病中普遍下调

。我们通过TargetScan数据库预测，ATG-9a是miR-29b的预测靶点。但miRNAs不独立参与生理和病理过程，一般受到lncRNAs的调控。因此我们进一步通过StarBase软件预测，NEAT1含有miR-29b的靶位点。本研究结果提示lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a生物轴参与HBV病毒复制过程，而且与HBV感染引起的慢性炎症损伤密切相关。

综上所述，在HBV感染相关疾病进展中，HBV通过lncRNA NEAT1/miR-29b/ATG-9a生物轴诱导自噬进而促进病毒复制，并且加重肝脏炎症损伤；在CHB发展至Cirr过程中，自噬活性增强，导致HBV DNA复制增加，病毒活跃，肝功能逐渐降低，但是发生癌变时，可能由于其他促癌基因的介入或者超过自噬的正常生理范围导致该通路活性降低，自噬被抑制，但是肝脏组织炎症损伤则进一步加重。

[1] 张维兰,罗和生.湖北地区肝硬化病因及相关分析[J].胃肠病学和肝病学杂志,2019,28(3):325-329.

[2] Zhang L.Autophagy in hepatitis B or C virus infection:An incubator and a potential therapeutic target[J].Life Sci,2020,242(2):117206.

[3] Xie M,Yang Z,Liu Y,

. The role of HBV-induced autophagy in HBV replication and HBV related-HCC[J].Life Sci,2018,205(7):107-112.

[4] Kunanopparat A,Kimkong I,Palaga T,

.Increased ATG5-ATG12 in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma and their role in apoptosis[J].World J Gastroenterol, 2016,22(37):8361-8374.

[5] 中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J].临床肝胆病杂志，2015，31(12)：1940-1960.

[6] 中国中西医结合学会消化系统专业委员会.肝硬化中西医结合诊疗共识[J].中西医结合消化杂志，2011，19(4):277-279.

[7] 中华人民共和国卫生部和计划生育委员会医政医管局，原发性肝癌诊疗规范(2017年版)[J].中华消化外科杂志，2017，16(7):635.

[8] 谢晓,陆伦根.乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗的进展[J].实用肝脏病杂志,2018,21(1):140-144.

[9] 彭佳丽,赖欣,韦嘉,等.自噬在HBV及相关肝脏疾病中的双重作用[J].临床肝胆病杂志,2018,34(10):2217-2220.

[10] 罗羽鸥,杨晓玲,李川,等.HBV-ACLF患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ的表达水平及其临床意义[J].标记免疫分析与临床,2020,27(4):586-590.

[11] Khabir M,Aliche AZ,Sureau C,

. Hepatitis delta virus alters the autophagy process to promote its genome replication[J].J Virol,2020,94(4):e01936-19.

[12] Imai K, Hao F, Fujita N,

. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation[J].J Cell Sci,2016,129(20):3781-3791.

[13] Kim SJ,Khan M,Quan J,

. Hepatitis B virus disrupts mitochondrial dynamics: induces fission and mitophagy to attenuate apopto-sis[J].PLoS Pathog,2013,9(12):e1003722.

[14] 郭海清,陈亚利,段钟平,等.细胞自噬与肝炎病毒感染的相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2015,24(4):381-384.

[15] Wu SY,Lan SH,Liu HS.Autophagy and microRNA in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol,2016,22(1):176-87.

[16] 王阳,车阳,高玉雪,等. 自噬相关基因Atg7的表达对乙型肝炎病毒复制的影响[J].中国医药导报,2020,17(2):4-8.

[17] Wang J,Chen J,Liu Y,

. Hepatitis B virus induces autophagy to promote its replication by the axis of miR-192-3p-XIAP through NF kappa B signaling[J].Hepatology,2019,69(3):974-992.

[18] 刘莉莉,苏何玲,刘永明,等.microRNA在HBV感染相关疾病中的作用[J].临床肝胆病杂志,2020,36(3):662-665.