灵芝菌粗酶液缓解糙米老化的条件优化

马誉畅，崔美林

（山西师范大学 食品科学学院，山西 太原 030031）

糙米是稻谷脱壳后不加工或较少加工所获得的全谷粒米，由米糠、胚和胚乳3大部分组成。与成品大米相比，糙米不仅含有更多的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等营养成分，同时还富含膳食纤维、谷维素、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、米糠多糖、二十八烷醇、肌醇等多种功能因子，具有极高的功能价值[1]。因此，在追求均衡营养、健康生活的现阶段，糙米的利用越来越受人们的关注。但是作为富含淀粉的谷物类，糙米与其他谷物一样存在淀粉易老化问题，老化后的淀粉，不仅口感变差，消化吸收率也随之降低，降低了其感官品质和营养价值，最终导致糙米食用价值明显下降[2]。因此，缓解淀粉老化是糙米扩大应用亟需解决的关键问题。目前多采用添加糖类[3]、乳化剂[4]、亲水胶体[5]及酶水解法[6]来减缓淀粉老化问题，其中酶解作用效果显著且高效无污染，逐渐成为缓解淀粉老化的主要方式之一[7]。在对糯米、米粉、马铃薯淀粉、馒头等的淀粉抗老化研究中发现，β-淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶和木聚糖酶均可以缓解淀粉老化[8-12]；此外，利用纤维素酶和酸性蛋白酶分解麸皮或麸质蛋白质，将其分解产物加入淀粉质食品中，同样能起到很好的抗老化作用，证明了此类分解产物亦具有抑制淀粉老化的效果[13]。

灵芝菌为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国名贵的药用真菌和新资源食品，有“益心气，助心充脉，安神，益肺气”等功效，具有重要的营养和药用价值[14]。同时，灵芝菌在发酵过程中可产生多种酶类，具备缓解淀粉老化的潜力。本文主要对灵芝菌发酵过程中的抗老化相关酶进行测定，并利用菌丝胞内酶液缓解糙米老化，以期为糙米的广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种与材料

灵芝菌株（赤芝，Ganoderma lucidum）：中国工业微生物菌种保藏中心；糙米：市售。

1.1.2 主要试剂

琼脂、蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；麦芽浸粉、VB1、3，5-二硝基水杨酸、木聚糖、福林（Folin）、乳酸钠、木糖、柠檬酸三钠、麦芽糖、酪蛋白、L-酪氨酸（纯度≥99%）：北京索莱宝科技有限公司；磷酸二氢钾、硫酸镁、可溶性淀粉、葡萄糖、乙酸钠、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、乳酸：天津光复精细化工研究所；三氯乙酸、乙酸、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

ZHY-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；LS-50HD立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；DPX-9052B-2电热恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司；SW-CJ-2D型净化工作台：苏州净化设备有限公司；JY92-IIDN超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司；752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；RVA-TecMaster快速黏度分析仪：瑞典波通仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基

斜面及平板培养基：马铃薯1%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，琼脂2%。121℃湿热灭菌20 min，VB1过滤除菌。

种子液培养基：马铃薯1%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5。121℃湿热灭菌 20 min，VB1过滤除菌。

发酵培养基：酵母浸粉1.8%，麦芽浸粉2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH6。121℃湿热灭菌20 min，VB1过滤除菌。

1.2.2 菌株培养

经斜面培养后，取4块～5块1 cm×1 cm菌丝小块接种于100 mL种子液培养基中，28℃、180 r/min条件下培养5 d即得灵芝种子液（取10 mL发酵5 d的种子液，离心后，当菌丝湿重达到0.3g左右，即为种子液发酵终点）。然后按10%接种量接入发酵培养基，于28℃、180 r/min下培养。

1.2.3 灵芝菌发酵胞外粗酶液制备

发酵完成后，取灵芝发酵液于5 000×g，4℃下离心15 min，上层液体即为胞外粗酶液。

1.2.4 灵芝菌发酵胞内粗酶液制备

发酵完成后，将菌株发酵液于5 000×g，4℃下离心15 min，收集菌丝沉淀，并用蒸馏水洗涤、离心，重复3次。按1∶60（g/mL）比例加入蒸馏水并用细胞破碎仪破碎菌丝，将所得匀浆液于5000×g，4℃下离心15min，上层液体即为胞内粗酶液。

1.2.5 酶活力测定

α-淀粉酶酶活力（Uα-淀粉酶）测定：采用李合生[15]的方法进行测定并稍加修改，即于65℃钝化β-淀粉酶[16-17]。测得麦芽糖标准曲线为Y=0.6333x+0.0349，R2=0.9999。酶活力的定义：1 mL酶液反应1 min产生相当于1 μg麦芽糖的酶量，为1个酶活力单位，以U表示。

β-淀粉酶酶活力（Uβ-淀粉酶）测定：参照李合生[15]的方法并稍加修改。取待测酶液于40℃水浴中预热10 min，采用 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定α-淀粉酶 +β-淀粉酶酶活力（U（α+β）-淀粉酶），β-淀粉酶酶活力按照公式（1）计算。

纤维素酶酶活力测定：参照文献[18]的方法进行测定。测得葡萄糖标准曲线为Y=0.5551x+0.028 7，R2=0.998 3。酶活力的定义：1 mL酶液反应1 min产生相当于1 μg葡萄糖的酶量，为1个酶活单位，以U表示。

酸性蛋白酶酶活力测定：灵芝菌发酵过程中pH值会迅速下降至4.0左右，该条件下所得蛋白酶即为酸性蛋白酶[14]，其测定参照Guo等[19]方法。测得L-酪氨酸标准曲线为Y=0.006 7x+0.010 3，R2=0.998 1。酶活力的定义：1 mL酶液1 min反应产生相当于1 μg酪氨酸的酶量，为1个酶活单位，以U表示。

木聚糖酶酶活力测定：参照Bailey等[20]的方法进行测定。木糖标准曲线为Y=0.136 8x-0.031 9，R2=0.997 2。酶活力的定义：1 mL酶液反应1 min产生相当于1 μg木糖的酶量，为1个酶活单位，以U表示。

1.2.6 灵芝菌粗酶液缓解糙米老化处理

挑拣颗粒饱满完整无裂痕、大小均匀的糙米，清洗沥干后按一定比例加入灵芝菌胞内粗酶液，于100r/min下恒温振荡处理一定时间，取出后清洗至表面无酶液残留并于100℃下灭酶1 min，最后于50℃烘干，磨粉过筛（100目）后冷藏备用。

1.2.7 缓解老化效果测定

用RVA-TecMaster型快速黏度分析仪对处理后的糙米粉进行糊化特性测定，根据结果计算得出回生值（setback，SB），回生值按公式（2）计算。

测试前，进行湿基校正，测定方法按照GB5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[21]。测量过程根据GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性测定快速粘度仪法》[22]方法进行。以未处理糙米为对照，根据公式（3）计算回生值比率。

式中：SB对照组为未处理糙米的回生值；SB试验组为经灵芝菌胞内粗酶液处理后糙米的回生值。

1.2.8 单因素试验

1.2.8.1 反应温度对缓解糙米老化的影响

称取10.0 g糙米，在液料比（即灵芝胞内粗酶液∶糙米）3∶1（mL/g）、反应时间 2 h 条件下，分别研究不同反应温度 22、28、34、40、46 ℃对抗老化的影响，以未处理为对照。

1.2.8.2 反应时间对缓解糙米老化的影响

称取 10.0 g糙米，在液料比 3∶1（mL/g）、反应温度34℃条件下，分别研究不同反应时间 1、2、3、4、5 h 对抗老化的影响，以未处理为对照。

1.2.8.3 液料比对缓解糙米老化的影响

称取10.0g糙米，在反应温度34℃、反应时间2h条件下，分别研究不同液料比 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g）对抗老化的影响，以未处理为对照。

1.2.9 响应面试验设计

利用Design-Expert V8.0.6进行Box-Behnken设计响应面试验，反应温度（A）、反应时间（B）、液料比（C）作为自变量，回生值比率（Y）为响应值，试验因素及水平设计如表1所示。

表1 响应面试验分析因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 数据处理

根据所得的各项试验数据，利用Excel进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，显著性水平为P＜0.05。采用Origin8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 灵芝菌发酵粗酶液酶活力测定

灵芝菌发酵5 d后，对其进行胞内与胞外粗酶液制备及酶活力测定，结果如表2所示。

表2 灵芝菌发酵胞内与胞外粗酶液酶活力Table 2 Enzyme activities of crude enzyme solution in intracellular and extracellular fermented broth of G.lucidum

由表2可知，灵芝菌发酵胞内粗酶液中，α-淀粉酶酶活力最高，可达（35 088.35±621.03）U/g，其次为纤维素酶酶活力，为（15 755.22±521.71）U/g，蛋白酶和β-淀粉酶酶活力较弱。胞外粗酶液中，α-淀粉酶酶活力较高，为（5 673.61± 394.61）U/g，其次为 β-淀粉酶和纤维素酶，蛋白酶酶活力最弱，为（826.24±51.87）U/g。对比胞内与胞外粗酶液中酶活力，我们发现胞内各酶酶活力均显著高于胞外。原因可能为上述酶均为胞外酶，主要由胞内分泌，并且在菌丝处理中采用细胞破碎仪进行破碎，可使胞内酶获得极大程度释放。然而，在测定中发现胞内与胞外粗酶液中均未测出木聚糖酶酶活力，这与刘建鹏等[23]的研究结果不一致，这可能与试验菌株的种类、培养环境等因素有关。基于上述结果，选择胞内粗酶液进行后续试验研究。

2.2 胞内酶液酶活力变化

分别取发酵1 d～7 d的灵芝菌进行胞内粗酶液制备及酶活力测定，结果如图1所示。

图1 灵芝菌发酵过程中胞内粗酶液酶活力变化Fig.1 Changes of enzyme activities in intracellular enzyme solution of G.lucidumin the process of submerged fermentation

在灵芝菌发酵过程中，4种酶的酶活力均呈现先上升后下降的趋势。其中，α-淀粉酶在第4天时酶活力达到最高值，为（69 496.21±1 250.72）U/g；β-淀粉酶酶活力第 3天达到最高值，为（9 616.89±0.00）U/g，第4 天为（9 607.24±335.73）U/g，二者无显著性差异；纤维素酶与酸性蛋白酶的酶活力均在第4天达到最大值，分别为（75 517.73±2 142.82）U/g和（7 515.79±204.08）U/g。在灵芝发酵至第3天时各酶酶活普遍大幅度上升并在第4天达到最大值，主要是由于这一阶段为灵芝菌大量繁殖的阶段，代谢最为旺盛。而在发酵后期由于营养物质匮乏与大量菌体自溶，各类酶的酶活均出现下降。这与陈志杰等[14]、许锡凯等[24]研究结果一致。

2.3 单因素试验结果分析

选取发酵第4天灵芝菌胞内粗酶液对糙米抗老化效果进行研究，分别从反应温度、反应时间和液料比3个因素进行试验，试验结果如图2～图4所示。

图2 不同反应温度对灵芝菌粗酶液缓解糙米老化的影响Fig.2 Effect of different temperature on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

图3 不同反应时间对灵芝菌粗酶液缓解糙米老化的影响Fig.3 Effect of different time on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

图4 不同液料比对灵芝菌粗酶液缓解糙米老化的影响Fig.4 Effect of different liquid-solid ratio on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

由图2可知，当反应温度小于34℃时，随着反应温度的升高，回生值比率呈上升趋势，抗老化效果显著提升。当反应温度为34℃时，回生值比率达到最大值为16.8%，当反应温度大于34℃时，回生值比率逐渐下降，抗老化效果下降，这可能是因为灵芝菌培养温度为28℃，其所含酶抗高温能力不强，当温度过高时会严重影响酶活，酶活开始下降。这与文献报道的真菌低温酶活力变化一致[25-26]。综上，34℃为最佳反应温度。

由图3可知，当反应时间小于2 h时，随着反应时间的延长，回生值比率明显提高；当反应时间为2 h时，回生值比率达到最大值，为16.7%；当反应时间大于2 h时，回生值比率逐渐下降，抗老化效果下降，这可能是因为反应时间越长，糙米颗粒表面的淀粉大部分被水解，酶对糙米的淀粉接触面变少，反应效率下降。此外，反应时间变长，淀粉颗粒进行不可逆吸水程度提高，水分含量上升，导致淀粉易老化、老化速度加快[27-28]，从而导致总体的回生值比率下降；并且反应时间越长，糙米浸泡时间越久，对糙米的形态造成严重影响，不利于糙米的食用和储藏。综上，2 h为最佳反应时间。

由图4可知，随着液料比的增加，回生值比率呈现先上升后下降的趋势。当液料比为4∶1（mL/g）时，回生值比率达到最大值为17.0%，当液料比大于4∶1（mL/g）时，回生值比率逐渐下降，抗老化效果下降，这可能因为酶与糙米接触面积已接近饱和[29]；而水分含量增多，糙米颗粒膨胀加大，淀粉颗粒游离，表面淀粉减少，酶与淀粉接触面减少，且淀粉颗粒进行不可逆吸水程度提高，水分含量上升，导致淀粉易老化、老化速度加快[27-28]，导致总体的回生值比率下降；并且液料比越大，原料成本越高。综上，4∶1（mL/g）为最佳液料比。

2.4 响应面优化糙米抗老化条件

2.4.1 回归方程的建立与方差分析

以回生值比率（Y）作为响应值，响应面试验设计方案与结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面试验设计方案与结果Table 3 Design program and results of response surfaces

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

对表3的数据进行多元回归方程拟合，得到回生值比率（Y）的二次回归模型：Y=0.241-0.017A+0.031B+0.024C+0.009AB+0.005AC-0.005BC-0.034A2-0.052B2-0.077C2。

由表4可知，回生值比率（Y）模型的P值为0.0001，回归模型方差极显著，拟合度较好；失拟项P值为0.975 8>0.05，不显著，表明通过试验得到的二次回归方程能较好地预测结果。二次多项式模型回生值比率（Y）的决定系数R2=0.973 7，这表明所建立的模型能够较好地拟合因子与响应值之间的关系。以回生值比率为响应值，一次项A表现为显著，一次项B、C以及二次项A2、B2、C2均表现为极显著。通过主因子效应分析可以得出，试验因素对抗老化影响的强弱顺序：反应时间>液料比>反应温度。

2.4.2 各因素相互作用分析

在响应面结果中，将其中1个因素固定，对另外2个因素进行分析得到响应曲面，曲面越陡峭，说明影响越显著[30]。各因素相互作用对响应值的影响结果见图5。

图5 各因素交互作用对灵芝菌粗酶液缓解糙米老化影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface map and contour diagram of the interaction of different factors against the effects on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

如图5（c）所示，随着液料比和反应时间的增加，回生值比率先上升至趋于平缓，随着液料比继续增加，回生值比率下降。但图形波动相对较为平稳，且对应等高线为圆形，由此可知，反应时间和液料比交互作用差异不显著，同理，其他因素交互作用差异不显著（P>0.05），此结果与表4所得结果一致。

2.4.3 抗老化条件的优化和验证

响应面结果分析得到灵芝胞内粗酶液缓解糙米老化的最优条件：反应温度31.869℃、反应时间1.967h、液料比 4.126∶1（mL/g），此时，所得到的回生值比率的预测值为24.6%。考虑到实际操作的可行性，修正反应条件：反应温度 32 ℃、反应时间 2 h、液料比 4∶1（mL/g）。在此优化条件下进行3次平行性试验，所得结果回生值比率为24.0%，结果与理论值无显著差异，由此可知，此模型可用于灵芝菌胞内粗酶液液对糙米抗老化的反应条件进行响应面优化，响应面所得的反应参数能有效缓解糙米老化，为糙米应用提供理论依据。

3 结论

本试验主要研究了灵芝菌发酵过程的α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶和酸性蛋白酶的酶活变化。其中，胞外粗酶液各类酶酶活力均明显低于胞内。而胞内粗酶液中，α-淀粉酶、纤维素酶和酸性蛋白酶的酶活力在发酵第4天达到最大，分别为（69 496.21±1 250.72）、（75 517.73±2 142.82）、（7 515.79±204.08）U/g，继而将发酵第4天的胞内粗酶液用于缓解糙米老化，经响应面优化后，最优条件为反应温度32℃，反应时间2 h，液料比4∶1（mL/g），此条件下所得回生值比率最高，可达24.0%。