NF-κB在心肌缺血再灌注损伤中的作用

杨涛 蔣艳

摘要： 目的 探究NF-κB在心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法 选取60只雌性小鼠随机分为四组每组各15只，分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、慢病毒对照（Ad-nc）组、慢病毒（Ad-SNHG1）组，所有小鼠再灌注损伤4h后处死小鼠，HE染色分析心肌组织病理变化，并选择Western blot分析心肌组织NF-κB信号通路变化，酶联免疫吸附测定小鼠外周血及心肌组织炎症水平。结果 慢病毒（Ad-SNHG1）组心肌NF-κB、血液HMGB-1、IL-10、Tn-1、P-NF-kBp65、TLR4免疫组化评分显著高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 心肌缺血再灌注损伤后NF-κB激活并释放大量炎症因子，增加心肌细胞负担。

关键词：核因子-κB;心肌缺血;灌注损伤

【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）06--01

急性心肌梗死为临床常见心血管疾病类型，随着溶栓、经皮冠状动脉介入治疗展开，心肌梗死致死率得到显著改善，但心肌梗死后缺血再灌注损伤成为新的难题[1]。核因子-κB（NF-κB）作为细胞中关键转录调节因子，刺激因子如脂多糖、病毒或肿瘤坏死因子等的活化诱导多种基因表达，产生多种细胞因子参与机体炎症反应[2]。分析心肌缺血再灌注损伤后NF-κB活性及炎症因子变化，对有效干预心肌缺血再灌注损伤具有良好指导作用。文章就建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，分析NF-κB及相关炎症因子变化，具体如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

健康雌性C57BL/60小鼠60 只，12周大，20～22g，清洁级。由桂林医学院动物实验中心提供（编号：62000700001045）。采取随机数字表法随机分为四组各15只，假手术组（Sham组）：实验时只扎线，不结扎、缺血再灌注组（I/R组）：结扎冠状血流30分钟，放松结扎线进行再灌注2小时，造成I/R损伤、慢病毒对照（Ad-nc）组：术前7d、2d尾静脉注射对照慢病毒，然后结扎冠脉造I/R损伤模型、慢病毒（Ad-SNHG1）组：术前7d、2d尾静脉注射Ad-SNHG1慢病毒，然后结扎冠脉造I/R损伤模型。

1.2 方法

1.2.1心肌缺血再灌注模型构建

将小鼠（C57BL/6，12周大）称重后，2.5%戊巴比妥麻醉。将小鼠仰卧位固定于手术操作台上。剪去颈部体毛，剪开颈部皮肤分离组织，气管切开连接小动物呼吸机，潮气量250 mL/min，呼吸频率120次/min。碘伏消毒，胸骨正中偏左侧切口分离肌肉，剪断第3-4根肋，用于胸器撑开胸骨，暴露小鼠心脏。提起包壁层剪开心包，暴露左心耳，在左心耳与肺动脉圆锥之间，找到行走于也肌内与也大静脉走向一致的冠状动脉前降支处进针，5-0无创缝合线穿过，进针深度为0.3-0.5 mm，在肺动脉圆锥旁出针。术中用针形电极连接小鼠四肢，心尖区表面的苍白表示缺血成功，心肌梗死模型的建立成功。120 min后松解结扎线，行再灌注，实验过程中维持机械呼吸支持。Sham组小鼠手术操作与上述基本相同，仅将缝合针穿线过左冠状动脉前降支，但不结扎该血管。

1.2.2心肌组织核质分离

取出生1-3天新生小鼠处死，心室剪碎至体积1mm3左右的颗粒，15 mL离心管中加入1 mL 0.1% II型胶原酶、0.2%胰酶混合液（1：1），37℃消化10 min轻轻吹打静置1分钟，收集上清液放置50 mL离心管，加入DMEM/F12+10%FBS培养基，重复6～7次直至组织消化成絮状沉淀物。收集細胞接种于35 mm的无菌培养皿中，培养30 min。上清液中的细胞再次贴壁45 min，仍悬浮的细胞接种于涂有明胶的培养皿中培养24 h，得到跳动的心肌细胞。

1.2.3Western blot分析蛋白表达

提取细胞蛋白和细胞核蛋白添加上样缓冲液，依据说明书操作作NF-KBp65（Ser536）、IkBa（Ser32）等蛋白表达水平，内参选择LaminB和Tubulin。

1.2.4血液样本处理

四组小鼠建模前及建模后4h分别经尾部取血，将12000rpm/min离心10min（离心半径8.2cm），将血清部分转移至新的离心管，用于ELISA检测。

1.2.5心肌组织细胞提取物制备

取四组小鼠心肌组织各0.1g并剪碎，放入放射免疫沉淀法组织裂解液200ul，在组织匀浆仪上匀浆，在冰上静置30min，1200×g，上清转移至新的离心管，用于ELISA检测组织炎症因子。

1.2.6ELISA分析炎症因子水平

取96孔板，设置标准品及待测样品孔，加入分离获取血清和组织上清液10ul，待测样本孔中添加辣根过氧化物酶标记的检测抗体100ul，依据说明书孵育、洗涤操作。终止反应后于酶标仪492nm处测定隔空吸光度值，依据样品OD值，计算各样本浓度值。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism v6.0和SPSS 18.0进行统计学数据分析，所有数据均以SD（标准差）表示。采用t检验分析两组间的差异，采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验区分三组或三组以上的差异。

2 结果

2.1四组小鼠心肌NF-κB水平比较

慢病毒（Ad-SNHG1）组心肌NF-κB水平显著高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2四组大鼠血浆中各ELISA指标含量分析

慢病毒（Ad-SNHG1）组HMGB-1、IL-10、Tn-1水平显著高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3四组小鼠心脏组织免疫组化评分结果

慢病毒（Ad-SNHG1）组P-NF-kBp65、TLR4免疫组化评分显著高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

缺血再灌注损伤所致组织损伤为一种与抗原无关炎症过程，病理生理十分复杂。既往研究指出[3]，氧化应激反应在缺血再灌注损伤病理过程中发挥着关键作用。缺血再灌注会引起无菌性炎症，获得性和固有免疫系统均被激活，如模式识别受体激活、炎症细胞浸润。

NF-κB则作为一种能特异的与免疫球蛋白的增强子KB序列结合的核蛋白转录因子，具有Rel同源结构域，是Rel蛋白家族成员。未活化状态下，NF-κB与抑制因子结合并形成NF-κB/IκB复合物，处于失活状态，定位于细胞质中。但经过外界刺激下会产生活性氧、细胞因子等。本次研究中指出，通过建立四组模型组，其中慢病毒（Ad-SNHG1）组NF-κB信号通路处于最高水平。主要是建模后，磷酸化NF-κBp65和磷酸化IκBa水平显著增加，p65蛋白大量进入细胞核，IκBa磷酸化水平增加，处于高激活状态，显著增加心肌缺血再灌注后NF-κB活性。同时，针对血清、免疫组化中相关指标分析后，心肌慢性损伤缺血再灌注后炎症因子、P-NF-kBp65、TLR4显著偏高，表明炎症因子作用下会造成心肌损伤。

综上所述，心肌缺血再灌注损伤后NF-κB激活并释放大量炎症因子，增加心肌组织损伤。

参考文献：

[1]戴文琴，黄县立，汪爱萍，等.小鼠心肌缺血再灌注损伤后NF-κB磷酸化状态及炎症因子的表达水平[J].国际免疫学杂志，2020，43（1）：26-30.

[2]韦皓，许玉霞，秦莉，等. HIF-1α通过TLR4/NF-κB信号通路对心肌缺血-再灌注大鼠心肌损伤的保护机制分析[J].临床和实验医学杂志，2019，18（10）：1017-1020.

[3]袁泉，夏中元，赵博，等. NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致脑损伤中的作用[J].医学研究杂志，2018，47（7）：55-58.