芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜核因子—κB DNA结合活性的影响

罗敏++++++李帅军++++++胡响当++++++王晓艳++++++林仁敬++++++杨周雨

[摘要] 目的 研究芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠核因子-κB（NF-κB）DNA结合活性的影响。 方法 将40只SD大鼠随机分为4组：正常组，模型组，芍药汤组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组。制备胃肠湿热型模型，然后采用三硝基苯磺酸（TNBS）制备灌肠法溃疡性结肠炎模型，灌胃治疗10 d后处死大鼠，取新鲜结肠黏膜标本提取核蛋白，利用以酶联免疫吸附测定（ELISA）为基础的Trans AMTM NF-κB P65试剂盒检测各组NF-κB相对活性。 结果 与正常组比较[（0.263±0.041）]，模型组大鼠NF-κB相对活性明显增高[（0.467±0.083）]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，芍药汤组大鼠结肠黏膜NF-κB相对活性明显降低[（0.271±0.089）]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 芍药汤能明显降低胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型结肠黏膜NF-κB相对活性，可能是其治溃疡性结肠炎作用的机制之一。

[关键词] 芍药汤；胃肠湿热；溃疡性结肠炎；核因子-κB

[中图分类号] R574.62；R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（c）-0004-03

溃疡性结肠炎（UC）的病因和发病机制迄今尚未明确，其中免疫因素在此病中所起的作用越来越受重视，研究已深入到细胞分子水平，特别是近年来研究发现核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）调控着UC患者中细胞因子和细胞黏附分子（cell adhesionmolecules，CAM）的释放，从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应。芍药汤出自《素问病机气宜保命集》，具有清热燥湿、调气和血的功效，根据多年的临床研究，对于胃肠湿热型UC，具有良好的疗效，为求进一步明确芍药汤干预UC调节作用机制，本实验通过检测NF-κB的DNA结合活性，从基因水平探讨芍药汤干预UC的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠40只，体重180～220 g，购自湖南中医药大学动物实验室[合格证号：SCXK（湘）2011～0003]，动物适应性饲养1周。

1.2 实验器材

核蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物公司）；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Tarns AMTM NF-κB酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海齐一生物物技有限公司）；ZFMQ050PE型超纯水器（上海摩勒科学仪器有限公司）；3K-30Z型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）。

1.3 实验阳性对照药物与试剂

柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海福达制药有限公司，批号：201310001，每片0.25 g），三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司），药物用蒸馏水配成50 g/L。

1.4 实验用药的制备

芍药汤超微颗粒由芍药、当归、黄连、槟榔、木香、黄芩、大黄、肉桂、甘草9味药组成。组方超微颗粒由湖南春光九汇现代中药有限公司提供，然后在湖南中医药大学附属第二医院制剂科，将药物用蒸馏水制成含生药1.32 g/mL水剂。

1.5 实验方法

1.5.1 造模及分组 将40只大鼠随机分为4组，每组各10只，正常组、模型组、芍药汤组、SASP组。除正常组外，其余3组首先参考文献[1-2]复制胃肠湿热模型：以高脂高糖饮食饲养大鼠，即在普通饲料喂养的基础上，加用200 g/L蜂蜜水自由饮用，每隔1 d按大鼠体重灌服油脂10 g/kg，并与油脂一起灌服10 mL/kg白酒，共10 d。然后再放入温度（32±2）℃，相对湿度为95%的人工气候箱中，共5 d。待胃肠湿热型模型造模成功后，再予以TNBS灌肠法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h，除正常组，其余各组大鼠先用乙醚麻醉，然后从肛门将大鼠灌胃针头轻轻插入，避免损伤肠道，深度约为8 cm，推入TNBS溶液（含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇）4 mL/kg体重，捏紧肛门平放5 min即可，术后予以常规饲养。待造模4 d后，随机从每组中抽出1只处死并解剖，游离其结肠组织，用生理盐水洗净后，观察距肛门7～8 cm处见肉眼可辨溃疡面，病理检查发现充血、水肿、隐窝脓肿和典型的溃疡等形成，确定造模成功。

1.5.2 给药方法与标本留取 确定造模成功后第2天，将大鼠按体表面积折算成成人等效剂量给药，芍药汤组折算后为含生药13.2 g/（kg·d），同理，SASP组折算后为0.5 g/（kg·d）。正常组和模型组大鼠用等体积量生理盐水经胃灌入。每组同时开始按上述剂量给药，1次/d，连续10 d。末次给药24 h后，以脱颈椎法将大鼠处死，提取距肛门8 cm结肠组织，并沿纵轴剪开，在结肠病变最明显处取0.5 cm结肠，以10%甲醛液固定、石蜡包埋，制成病理切片，HE染色后光镜下查看；余下部分刮取结肠黏膜组织，每只大鼠刮取50 mg新鲜结肠黏膜，立即提取核蛋白。利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB P65试剂盒检测各组NF-κB相对活性。

1.6 观察指标

①观察大鼠的体重、大便、食欲、活动度、精神状态等；②结肠大体病理及组织学改变：观察大鼠结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、等情况，观察黏膜有无水肿、糜烂、溃疡、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润等改变；③利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB P65试剂盒检测NF-κB的DNA结合活性。

1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

正常组大鼠体重、大便、饮食、活动均正常。其余3组大鼠在造模后3 d内均逐渐出现蜷缩、倦怠懒动、反应迟钝、拱背、便软、便溏等症状，有的黏液便甚至可见肉眼血便。造模第4天每组随机抽出一只处死后取结肠，除正常组外剩下各组结肠组织肉眼可见溃疡面。芍药汤组和阳性对照组在用药4 d以后，上述情况开始逐渐改善，进食量明显增加，伴随体重增加明显，到用药后期时，大便多呈颗粒状，黏液便、血便等基本消失。模型组后期血便等症状有所改善，但大便仍不成形并大便臭秽。

2.2 结肠大体病理及组织学改变

正常组大鼠肠黏膜上皮细胞排列整齐，腺体结构规则，各层次构造清楚，没有发现炎症细胞及溃疡（图1 a，封三）。其余组所取结肠组织可见黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡，有的出现瘢痕形成，部分结肠扩张、黏膜皱襞变浅，以模型组最为严重（图1 b，封三）。SASP组和芍药汤组病变明显减轻，可见充血、水肿、糜烂和红色瘢痕（图1 c～d，封三）。

2.3 NF-κB 活性

与正常组比较，模型组大鼠NF-κB相对活性明显增高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，芍药汤组大鼠结肠黏膜NF-κB相对活性明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

3 讨论

UC临床上主要以腹泻为主，排出含有血、脓和黏液的粪便，同时常伴有阵发性结肠痉挛性疼痛，并里急后重，排便后可获缓解。本实验中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出现腹泻、黏液脓血便等症状，肠道主要表现为水肿、充血、糜烂，镜下可见大量中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，在病理学和免疫学特征上与溃疡性结肠炎病患者相似[3-6]。溃疡性结肠炎是多种因素、多种机制相互作用的结果。同时研究还发现，各种细胞因子能够相互作用形成复杂的细胞因子网络，加重炎性反应，从而导致黏膜损伤，这在溃疡性结肠炎的发生发展中起着十分重要的作用[6-7]。

有研究表明，许多与炎症和免疫反应关系密切的趋化因子、黏附因子等重要因子均含有κB位点，活化的NF-κB能与特定的κB位点结合，启动调节参与机体的炎症和免疫有关的基因转录，在机体的炎症、免疫方面发挥重要作用[9-13]。NF-κB是可跟γ-球蛋白轻链基因的增强子GGGACTTTCC（B序列）结合的一种核蛋白，它在基因表达的先天免疫反应、细胞增殖及分化中有重大作用，其中作为诱导UC发病的促炎因子如肿瘤坏死因子α、白介素6等，已被证实由核因子κB调节控制他们的转录水平，核因子κB的活化可以控制多种促炎因子的基因转录，这证明它在UC发病中的作用重大，UC发病时NF-κB呈过激活状，放大炎性反应[13-18]。

芍药汤出自《素问病机气宜保命集》，具有清热燥湿、调气和血的功效。在临床运用中，针对胃肠湿热型的UC能取得很好的治疗效果。方中黄芩、黄连性味苦寒，入大肠经，具有清热燥湿解毒的功效，以除致病之因，为君药。方中重用芍药养血和营、缓急止痛，再配以当归养血活血，体现了“行血则便脓自愈”之义，且可兼顾湿热邪毒熏灼肠络，伤耗阴血之虑；木香、槟榔行气导滞，“调气则后重自除”，四药相配，调和气血，是为臣药。大黄苦寒沉降，合芩连则清热燥湿之功著，合归、芍则活血行气之力彰，其泻下通腑作用可通导湿热积滞从大便而去，体现“通因通用”之法。方以少量肉桂，其辛热温通之性，既可助归、芍行血和营，又可防呕逆拒药，属佐助兼反佐之用。炙甘草和中调药，与芍药相配，又能缓急止痛，亦为佐使。诸药合用，湿去热清，气血调和，故下痢可愈。

本实验发现经芍药汤治疗过的胃肠湿热型UC大鼠，其结肠NF-κB的表达显著降低，可能是芍药汤阻断NF-κB的激活，减少NF-κB的活化诱导因素从而降低了NF-κB p65的表达，起到治疗UC的作用。

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（收稿日期：2014-10-19 本文编辑：苏 畅）