AtCPS V326M突变显著影响赤霉素合成

赵三增，孔丹宇，辛培勇，褚金芳,5，万迎朗，凌宏清，刘毅,4

研究报告

AtCPS V326M突变显著影响赤霉素合成

赵三增1，孔丹宇2，辛培勇3，褚金芳3,5，万迎朗1，凌宏清4,5，刘毅2,4

1. 海南大学热带作物学院，海口 570228 2. 中国科学院庐山植物园，江西庐山 332900 3. 中国科学院遗传与发育生物学研究所，国家植物基因研究中心(北京)，中国科学院种子创新研究院，北京 100101 4. 中国科学院遗传与发育生物学研究所，植物细胞与染色体工程国家重点实验室，中国科学院种子创新研究院，北京 100101 5. 中国科学院大学现代农学院，北京 100039

赤霉素(gibberellins, GA)是植物激素之一，调控植物生长和发育。植物体中赤霉素合成量直接影响植物的形态和生物量。在赤霉素合成途径中，柯巴基焦磷酸合酶基因(copalyl diphosphate synthase,)是第一个合酶基因，该基因突变会严重影响赤霉素合成量。本研究通过对根和下胚轴缩短、晚花、丛生、矮化的拟南芥()突变体进行图位克隆，鉴定出的一个等位基因。该等位基因的突变位点是基因的第2768位核苷酸，鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致AtCPS蛋白萜类合酶(Terpene_synth)结构域中的第326位缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)。通过等位分析确定是的等位基因。遗传互补实验显示AtCPS V326M突变导致植物丛生、矮化等发育缺陷表型。赤霉素含量测定结果证明AtCPS V326M突变导致赤霉素的合成量减少。外施赤霉素实验结果表明，外施赤霉素能恢复拟南芥突变体赤霉素合成量降低导致的植株丛生、矮化等发育缺陷表型。因此，本研究为通过定点突变赤霉素合成酶基因的特定位点改变赤霉素含量来塑造植物理想株高和株型提供理论指导。

赤霉素；基因；根长；株型；株高

赤霉素(gibberellins, GA)是植物经典激素之一，主要控制种子萌发、茎干伸长以及叶片、花和种子发育等重要过程[1,2]，对植物生长和发育起着关键调控作用。在拟南芥()中，赤霉素缺失时，DELLA蛋白与响应GA信号促进植物生长的转录因子结合，使这些转录因子不能行使转录活性，抑制植株生长[3]。当赤霉素与其受体GID1结合，会与DELLA蛋白形成GA-GID1-DELLA复合体，E3泛素连接酶复合体SCFSLY1识别并结合GA-GID1- DELLA复合体中的DELLA蛋白，将其泛素化，促使DELLA蛋白通过26S蛋白降解途径降解，释放与DELLA蛋白结合的转录因子，启动GA信号响应基因的表达，促进植株生长[4]。

赤霉素是一类双萜次生代谢物，目前共发现136种，按照其发现顺序，分别被命名为GA1～GA136，可分为含20个碳原子和19个碳原子两大类[1,5,6]。其中具有生物学活性的赤霉素主要有GA1、GA3、GA4和GA7，都属于含19个碳原子类赤霉素。在绝大多数植物中，GA1和GA4是最主要的活性赤霉素形式，并且GA4的活性显著高于GA1[6]。赤霉素的合成以牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGDP)为前体，整个合成途径可按照合成场所分为3个阶段：第一阶段是位于前质体的可溶性酶柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase, CPS)和贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase, KS)将牻牛儿基焦磷酸催化成贝壳杉烯[7]；第二阶段是在内质网中贝壳杉烯先被氧化成赤霉素的通用前体GA12，并进一步被不同的细胞色素P450单氧化酶催化成多种不同的赤霉素形式或其中间体；第三阶段是由位于细胞质中多基因家族的加双氧酶GA20氧化酶(GA20ox)、GA3氧化酶(GA3ox)以及GA2氧化酶(GA2ox)依次完成。通过GA20ox和GA3ox的催化作用，生成具有生物学活性的GA1和GA4，而GA2ox则是将GA1和GA4代谢成不具有生物学活性的赤霉素[5,8]。

在被子植物中，和两个独立的双萜合酶基因，分别编码CPS蛋白和KS蛋白[9]。其中，CPS含有保守结构域DXDD，属于第二类双萜合酶，催化完成赤霉素合成途径中的第一步反应，使牻牛儿基焦磷酸形成焦磷酸柯巴酯[5,6]。焦磷酸柯巴酯进一步被归属第一类双萜合酶的KS催化成贝壳杉烯。这两个酶共同作用完成赤霉素合成的第一阶段。而在苔藓等低等植物中，CPS/KS双萜合酶被认为是CPS和KS的融合蛋白，同时存在CPS的保守结构域DXDD和KS的保守结构域DDXXD，是一个既具有CPS酶活又具有KS酶活的双功能双萜合酶，可直接将牻牛儿基焦磷酸催化成贝壳杉烯。该酶单独完成赤霉素合成的第一阶段[10]。拟南芥中基因(At4g02780)只有一个拷贝，该基因也被称为基因，突变后会导致种子萌发困难，植株极度矮小，叶片小而深绿，花瓣、萼片和雌蕊严重发育不全、雄性败育，外施赤霉素可以恢复突变体表型[7]。过表达基因，可以显著提高植株中内根–贝壳杉烯和内根–贝壳杉烯酸含量，但不影响赤霉素合成途径中内根–贝壳杉烯酸之后的中间产物和活性赤霉素的含量[9]。水稻中有4个基因(～)，其中、负责将牻牛儿基焦磷酸催化成内根–焦磷酸柯巴酯，是一个假基因，将牻牛儿基焦磷酸转化成同向–焦磷酸柯巴酯。进一步研究表明在水稻中基因主要参与赤霉素的合成，而和参与植保素的合成[11～14]。

20世纪60年代开始的第一次绿色革命，就是利用水稻(L)中的赤霉素合成基因和小麦(L)中的信号转导基因的优异等位基因培育出矮杆、抗倒伏、高产新品种，极大推动了粮食产量的提升[15,16]。这些研究表明赤霉素对农作物的株型、育性以及收获指数影响很大。因此，发掘赤霉素合成量适度的农作物基因型仍然是提高作物产量切实可行的办法之一。本研究在拟南芥EMS (ethyl methyl sulfone)诱变突变体库中通过图位克隆的方法克隆了一个等位突变基因。在该突变体中，等位基因的第2768位核苷酸由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)使AtCPS第326位缬氨酸突变成蛋氨酸，致使突变体中赤霉素合成量明显的降低以及株型显著改变。本研究结果以期为如何改善农作物赤霉素合成量，构建赤霉素合成量适度的农作物新品种提供新思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料及培养方法

本研究所用的植物材料是由本实验室保存的拟南芥的两种生态型Columbia-0 (Col-0)和Landsberg(Ler)；突变体是本实验室保存的基因的T-DNA插入缺失突变体。突变体从拟南芥EMS诱变突变体库中(Col-0背景)筛选获得。拟南芥培养基平板培养：将消毒后的拟南芥种子播种在1/2 MS (Murashige and Skoog)固体培养基上，竖直倾斜30°放置在22℃培养箱中，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光照强度为15,000 Lx。拟南芥土中培养：将10 d的拟南芥幼苗移栽到培养土中，放置在22℃培养间，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光照强度为15,000 Lx。

1.2 菌株、质粒、引物合成

本实验所用的菌株包括：大肠杆菌菌株DH5α；农杆菌菌株GV3101；本实验所用的转化载体为；本研究所有引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.3 根长和下胚轴测定实验

对在22℃、16 h光照/8 h黑暗条件下1/2 MS固体培养基上竖直培养10 d的拟南芥幼苗的主根和下胚轴的长度进行测定，进行3次生物学重复，每次重复每个基因型不少于20株。根长和下胚轴的显著性差异的统计分析采用-test检验。

1.4 F2群体构建

利用拟南芥Col-0为母本，突变体为父本进行杂交，杂交F1植株用来验证突变基因的显隐性，杂交F1植株自交后得到的F2群体用来考察性状分离比。以Ler为母本，突变体为父本进行杂交得到杂交F1植株，F1植株经自交一代获得F2分离群体，选取矮化单株用于后续图位克隆。

1.5 图位克隆

图位克隆方法详见参考文献[17]，分子标记引物序列见表1。

1.6 拟南芥基因组DNA、RNA提取及反转录

取拟南芥Col-0植株幼嫩莲座叶，放入2 mL离心管中，细胞破碎仪破碎后，加入500 μL 65℃预热的CTAB溶液，振荡摇匀。65℃水浴中放置20 min。冷却至室温后，加入300 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀。1000 r/min离心10 min，吸上层液体至新离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀。–20℃放置40 min。12,000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀用70%乙醇清洗1～2次，干燥后加入超纯水溶解，放入–80℃储存。

表1 分子标记引物序列

取拟南芥Col-0植株幼嫩莲座叶，使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)依照说明书提取总RNA。反转录使用SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒(美国Invitrogen公司)，使用方法参照说明书。

1.7 ga1-168遗传互补载体的构建、转化与筛选

利用引物p-I LP(5′-GTTTTG­CAAACTCGATCTAC-3′)和p-I(5′-GGCTTTAAAAAGCTCTGT-3′)，以Col-0基因组DNA为模板，通过PCR扩增基因的启动子区。用引物CDS-I(5′-ATGTCT­CTTCAGTATCATG-3′)和CDS-I(5′-CTAGACTTTTTGAAACAAG-3′)，以反转录的Col-0 cDNA为模板，通过PCR扩增出的基因编码区。通过酶切连接的方法，将启动子和编码区片段连接到载体中。将连接好的载体转化大肠杆菌DH5α菌株，转化载体经扩繁后转入农杆菌GV3101菌株中。取生长状况良好，有大量花苞的突变体植株，通过滴花转化法转化植株，利用Kan抗性筛选获得互补株系。

1.8 CPS蛋白序列的比对

小立碗藓()、江南卷柏()、无油樟()、甜菜()、甘蓝()、毛果杨()、大豆()、葡萄()、水稻、玉米()和高粱() CPS蛋白序列在Ensemble Plants (https://plants.ensembl.org/index.html)通过AtCPS蛋白比对获得，CPS蛋白序列比对结果通过Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)完成。

1.9 GA3喷施实验

对土中培养2周的拟南芥幼苗，喷施50 μmol/L GA3，每天喷施一次，连续喷施7 d后观察表型。

1.10 赤霉素测定

赤霉素的定量测定方法参照文献[18]。取土里正常培养30 d的野生型Col-0和突变体地上部，在研钵中用液氮充分研磨后，用90%的甲醇水溶液提取100 mg的液氮研磨粉末，加入需要检测GA的标记物各2 ng作为内参。将赤霉素初提物通过固相萃取柱萃取后融入40%甲醇中，通过UPLC- MS/MS进行定量检测。

2 结果与分析

2.1 ga1-168的突变基因是AtCPS基因

通过筛选拟南芥Col-0 EMS诱变突变体库，筛选出一个突变株(图1：A和B)。该突变体生长1周的幼苗根较野生型短，为野生型根长的4/5；下胚轴的长度也较野生型短，仅为野生型的2/5 (图1C)。在16 h光照/8 h黑暗的光照条件下，突变体的抽薹时间比野生型晚一周左右。株型呈丛生状，株高是野生型的一半(图1D)。以野生型Col-0和为亲本，构建F2分离群体，在1348株F2植株中呈现突变体表型(根短、下胚轴短、晚花)的个体为342株，其余1006个植株表型与野生型相近。经卡方检验发现F2群体分离比符合3∶1的理论值(c2=0.0989，c20.05,1=3.84)，由此推测，突变体表型是受单个隐性基因控制。

利用拟南芥Ler生态型与杂交得到的F2分离群体进行图位克隆，突变体基因定位于4号染色体短臂的SSLP分子标记CIW5与F2C21之间。通过进一步遗传精细定位分析，将突变基因定位于CAPS分子标记T5J8I和T5J8178 III之间。通过对这两个分子标记之间的9个基因进行测序分析，发现突变位点位于基因的第7个外显子的第2768位，核苷酸从鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致AtCPS蛋白第326位的缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)。经Pfam domain分析，发现V326位于Terpene_ synth(272～478 aa)结构域中(图2)。

图1 突变体ga1-168的表型分析

A：Col-0和幼苗在1/2 MS培养基上生长7 d的根长表型；B：Col-0和幼苗在1/2 MS培养基上生长7 d后主根长度统计分析；C：Col-0和幼苗在1/2 MS培养基上生长7 d后下胚轴长度统计分析；D：Col-0和幼苗在土中生长的株高表型。误差线上方不同的小写字母标示代表彼此间有统计学差异(<0.05)，若无标示或用相同字母标示则代表无统计学差异。

图2 突变体ga1-168的图位克隆

黑色竖线代表分子标记；虚线指示为两标记间区段的放大；黑色方框代表外显子，黑色方框之间的线代表内含子；淡黄色方框代表AtCPS蛋白的(Terpene_synth) (272～478 aa)结构域，其中第326位的缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)。红色圆点代表染色体着丝粒，蓝色方框代表AtCPS蛋白的萜类合酶C (Terpene_synth_C) (522～596 aa)结构域。

2.2 V326在植物进化过程中高度保守

为检测V326的保守性，利用AtCPS的蛋白序列在EnsemblePlants网站比对，获取小立碗藓、江南卷柏、无油樟、甜菜、甘蓝、毛果杨、大豆、葡萄、水稻、玉米和高粱共11个物种的17个同源基因。通过Clustal Omega比对发现，V326位点在所检测物种的同源基因中都是保守的。仅在参与植保素合成，而不参与赤霉素合成的水稻OsCPS4蛋白中该位点突变演化成亮氨酸(L)(图3)。该结果提示V326位点对CPS的蛋白功能十分重要。

图3 CPS V326区域比对结果

利用Clustal Omega在17个物种中对CPS蛋白序列进行比对，红色*代表V326位点，最后的一列数字代表其左侧氨基酸在CPS蛋白中的位置。Pp：小立碗藓；Sm：江南卷柏；Atr：无油樟；Bv：甜菜；Bo：甘蓝；Pt：毛果杨；Gm：大豆；Vv：葡萄；Os：水稻；Zm：玉米；Sb：高粱。

2.3 AtCPS V326M导致ga1-168生长发育缺陷表型

为确定基因突变导致了的表型，本研究采用基因的启动子驱使自身的基因编码序列，通过转基因的方式构建出互补株系com。comT2代纯合单插入株系的根长与野生型Col-0一致(图4A)，株型和株高也与野生型一致(图4：B和C)，这说明基因能完全互补突变体的生长发育缺陷表型。将T-DNA插入突变体与进行杂交，杂交F1植株的根长与一致(图4：B和C)，F1植株的株型和株高也与一致(图4A)，等位分析表明与的突变基因是等位基因。

2.4 ga1-168赤霉素合成量显著降低

是拟南芥赤霉素合成途径中的第一个关键基因，直接影响拟南芥的赤霉素合成量。的表型也暗示在中赤霉素合成量减少。采集在16 h光照/8 h黑暗条件下生长30 d的Col-0和的地上部分材料，通过质谱检测赤霉素合成途径的14种关键赤霉素含量。结果发现Col-0中的赤霉素含量普遍高于。其中GA12、GA15、GA34在Col-0中的含量分别为0.603±0.048 ng/g、0.505±0.007 ng/g、1.000±0.071 ng/g，而在中的含量仅为0.019±0.004 ng/g、0.246±0.015 ng/g、0.149±0.018 ng/g (表2)。另外，GA4、GA9、GA20、GA24、GA44、GA51在Col-0中的含量分别为0.466±0.026 ng/g、0.207±0.014 ng/g、0.399±0.013 ng/g、1.550±0.081 ng/g、0.220±0.026 ng/g、0.732±0.059 ng/g，而中则没有检测到这几种赤霉素(表2)。其余的赤霉素GA1、GA7、GA8、GA19和GA53在Col-0和的样品中都没有被检测到。

图4 突变体ga1-168突变基因的确定

A：土中生长40 d的Col-0、、突变体、互补植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1的株高表型；B：Col-0、、突变体、互补植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1在1/2 MS培养基上生长7 d的根长表型；C：Col-0、、突变体、互补植株com和Col-0♀ ×♂ F1♀ ×♂ F1根长表型的统计分析；D：对移栽到土里的和小苗连续喷施GA37 d后的表型。误差线上方不同的小写字母标示代表彼此间有统计学差异(<0.05)，若无标示或用相同字母标示则代表无统计学差异。

表2 Col-0和ga1-168中赤霉素含量(ng/g FW)

ND：未检测到。

2.5 外施赤霉素GA3可以恢复ga1-168表型

为进一步确认的株型和株高的表型是由于赤霉素缺失导致，本研究对移栽到土里的和小苗喷施50 μmol/L GA3，连续喷施7 d后，在株型和株高上都与野生型Col-0一致，而的表型仅得到部分恢复(图4D)。结果表明，的丛生株型和较矮株高的表型是由赤霉素缺失导致。

3 讨论

3.1 CPS基因的进化

藻类低等生物中可能没有赤霉素的内源合成，因为比对发现莱茵衣藻()没有的同源基因。基因在细菌、真菌和植物中广泛存在。基因存在方式主要有两种：一种是在真菌和苔藓植物中的CPS/KS融合蛋白，同时具有CPS和KS酶的酶活；另外一种方式是细菌和维管植物中独立的CPS蛋白。基因在某些物种中还演化成多个同源基因，如在江南卷柏、毛果杨和水稻中都有3个基因。已有报道证实水稻的3个基因中，仅参与赤霉素的合成途径，而与已特化成合成植保素的合成基因[11～14]。江南卷柏也有同源基因存在功能特化，不再参与赤霉素的合成[19]。这预示毛果杨中的某些基因也有可能不再参与赤霉素合成。另外，虽然处于植物进化不同阶段的江南卷柏、毛果杨和水稻都有3个基因，但这些物种中基因的复制应该是独立进行的。因为处于这3个物种进化中间的一些物种，如无油樟、大豆以及玉米等都只有一个基因。

3.2 V326对CPS酶活的重要性

本研究发现AtCPS蛋白的326位氨基酸从缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)后，拟南芥合成赤霉素的能力显著下降，这一结果暗示V326对AtCPS酶活十分重要。V326处于萜类合酶(Terpene_synth)结构域中，在检测的植物CPS中(除OsCPS4外)该位点高度保守，且与V326相邻的P325和D327也都是保守的。这暗示该区域可能对CPS的功能十分重要。蛋白结构解析结果表明虽然V326不参与底物的直接结合，但其所处位置却与底物发生成环反应的位置十分接近[20]。因此，V326M突变有可能直接影响底物的成环反应效率。另外，虽然缬氨酸与蛋氨酸的极性相同，但蛋氨酸的侧链较缬氨酸侧链长，除V326可能直接影响到CPS酶活外，较长的侧链影响底物的结合效率或装载效率，这也可能是导致CPS酶活下降的原因。除此之外，经Alphafold分析CPS的蛋白结构发现V326与D110可以形成一个氢键[21]，该氢键可能对保持CPS酶活非常重要，所以V326M会严重影响CPS酶活。

3.3 赤霉素是影响粮食产量的重要激素

赤霉素作为经典的植物激素之一，参与植物的生长发育过程。带来第一次绿色革命的是利用水稻赤霉素合成基因和小麦的信号转导基因的优异等位变异，其中基因编码GA20ox，该基因的突变导致水稻中的赤霉素合成量减少，优异等位变异使水稻植株变矮、抗倒伏、高产、收获指数显著提高[15,16]。但这并不表示赤霉素在粮食产量上的潜力已经被完全挖掘。Hu等[22]通过CRISPR/Cas9系统编辑水稻基因，得到一系列高产的突变体。本研究发现的V326位点是一个影响AtCPS酶活的关键位点，该位点的突变会显著降低体内赤霉素的合成量。因此，可以通过定点编辑粮食作物中基因的这一位点或其他一些影响CPS酶活的关键位点[20,23]，实现粮食作物最适赤霉素合成量，从而进一步提高粮食作物的收获指数和产量。

[1] Hedden P, Sponsel V. A century of gibberellin research., 2015, 34(4): 740–760.

[2] Hernández-García J, Briones-Moreno A, Blázquez MA. Origin and evolution of gibberellin signaling and metabo­lism in plants., 2021, 109: 46–54.

[3] Davière JM, Achard P. Gibberellin signaling in plants.2013, 140(6): 1147–1151.

[4] Claeys H, De Bodt S, Inzé D. Gibberellins and DELLAs: central nodes in growth regulatory networks., 2014, 19(4): 231–239.

[5] Hedden P, Thomas SG. Gibberellin biosynthesis and its regulation., 2012, 444(1): 11–25.

[6] Salazar-Cerezo S, Martínez-Montiel N, García-Sánchez J, Pérez-Y-Terrón R, Martínez-Contreras RD. Gibberellin biosynthesis and metabolism: a convergent route for plants, fungi and bacteria., 2018, 208: 85–98.

[7] Sun TP, Kamiya Y. TheGA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis., 1994, 6(10): 1509–1518.

[8] Hedden P. The current status of research on gibberellin biosynthesis., 2020, 61(11): 1832–1849.

[9] Fleet CM, Yamaguchi S, Hanada A, Kawaide H, David CJ, Kamiya Y, Sun TP. Overexpression of AtCPS and AtKS inconfers increased ent-kaurene production but no increase in bioactive gibberellins., 2003, 132(2): 830–839.

[10] Hayashi K, Kawaide H, Notomi M, Sakigi Y, Matsuo A, Nozaki H. Identification and functional analysis of bifun­ctional ent-kaurene synthase from the moss.,2006, 580(26): 6175–6181.

[11] Otomo K, Kenmoku H, Oikawa H, König WA, Toshima H, Mitsuhashi W, Yamane H, Sassa T, Toyomasu T. Biological functions of ent- and syn-copalyl diphosphate synthases in rice: key enzymes for the branch point of gibberellin and phytoalexin biosynthesis., 2004, 39(6): 886–893.

[12] Prisic S, Xu MM, Wilderman PR, Peters RJ. Rice contains two disparate ent-copalyl diphosphate synthases with distinct metabolic functions., 2004, 136(4): 4228–4236.

[13] Toyomasu T, Usui M, Sugawara C, Kanno Y, Sakai A, Takahashi H, Nakazono M, Kuroda M, Miyamoto K, Morimoto Y, Mitsuhashi W, Okada K, Yamaguchi S, Yamane H. Transcripts of two ent-copalyl diphosphate synthase genes differentially localize in rice plants according to their distinct biological roles., 2015, 66(1): 369–376.

[14] Xu MM, Hillwig ML, Prisic S, Coates RM, Peters RJ. Functional identification of rice syn-copalyl diphosphate synthase and its role in initiating biosynthesis of diterpenoid phytoalexin/allelopathic natural products., 2004, 39(3): 309–318.

[15] Gao SP, Chu CC. Gibberellin metabolism and signaling: Targets for improving agronomic performance of crops., 2020, 61(11): 1902–1911.

[16] Hedden P. The genes of the Green Revolution., 2003, 19(1): 5–9.

[17] Ling HQ, Bauer P, Bereczky Z, Keller B, Ganal M. The tomatogene encoding a bHLH protein controls iron-uptake responses in roots., 2002, 99(21): 13938–13943.

[18] He J, Chen QW, Xin PY, Yuan J, Ma YH, Wang XM, Xu MM, Chu JF, Peters RJ, Wang GD. CYP72A enzymes catalyse 13-hydrolyzation of gibberellins., 2019, 5(10): 1057–1065.

[19] Shimane M, Ueno Y, Morisaki K, Oogami S, Natsume M, Hayashi K, Nozaki H, Kawaide H. Molecular evolution of the substrate specificity of ent-kaurene synthases to adapt to gibberellin biosynthesis in land plants., 2014, 462(3): 539–546.

[20] Köksal M, Hu HY, Coates RM, Peters RJ, Christianson DW. Structure and mechanism of the diterpene cyclase ent-copalyl diphosphate synthase., 2011, 7(7): 431–433.

[21] Jumper J, Evans R, Pritzel A, Green T, Figurnov M, Ronneberger O, Tunyasuvunakool K, Bates R, Žídek A, Potapenko A, Bridgland A, Meyer C, Kohl SAA, Ballard AJ, Cowie A, Romera-Paredes B, Nikolov S, Jain R, Adler J, Back T, Petersen S, Reiman D, Clancy E, Zielinski M, Steinegger M, Pacholska M, Berghammer T, Bodenstein S, Silver D, Vinyals O, Senior AW, Kavukcuoglu K, Kohli P, Hassabis D. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold., 2021, 596(7873): 583–589.

[22] Hu XM, Cui YT, Dong GJ, Feng AH, Wang DY, Zhao CY, Zhang Y, Hu J, Zeng DL, Guo LB, Qian Q. Using CRISPR-Cas9 to generate semi-dwarf rice lines in elite landraces., 2019, 9(1): 19096.

[23] Köksal M, Potter K, Peters RJ, Christianson DW. 1.55Å-resolution structure of ent-copalyl diphosphate synthase and exploration of general acid function by site-directed mutagenesis., 2014, 1840(1): 184–190.

AtCPS V326M significantly affect the biosynthesis of gibberellins

Sanzeng Zhao1, Danyu Kong2, Peiyong Xin3, Jinfang Chu3,5, Yinglang Wan1, Hong-Qing Ling4,5, Yi Liu2,4

Gibberellins are a class of typical phytohormones, which regulate plant growth and development. The contents of gibberellins dramatically affect the morphology and biomass of plant. The encoding protein of copalyl diphosphate synthasegene() catalyzes the first-step in the biosynthetic pathway of gibberellins. The mutation in this gene may significantly affect the contents of gibberellins in plants. In this study, we found an EMS-triggered mutant,, showing short roots, short hypocotyls, late flowering and dwarf. Map-based cloning revealed that the causal gene ofwas, an allele ofgene. The encoding protein ofwas AtCPS V326M which was resulted from a single-point mutation (guanine to adenine at nucleotide 2768) ofgene. Protein domain analysis showed that V326 was located in the Terpene_synth domain. The allelism test demonstrated thatwas an allele ofgene. The transgenic complementation ofindicated that AtCPS V326M led to the dwarf and bushy phenotype of. The endogenous gibberellins contents analysis suggested that the gibberellins contents ofwere much lower than that of wild-type. The exogenous GA3application assay uncovered that application of GA3can complement the dwarf and bushy phenotype ofcaused by low endogenous gibberellins contents. Therefore, this study suggested that it is an elegant way to create the ideal plant architecture and height by site-directed mutating the gibberellin biosynthetic genes.

gibberellins;gene; root length; plant architecture; plant height

2021-11-26;

2022-01-19;

2022-02-22

国家自然科学基金青年项目(编号：31900171)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31900171)]

赵三增，在读硕士研究生，专业方向：分子遗传学。E-mail: 834395875@qq.com

凌宏清，博士，研究员，博士生导师，研究方向：分子遗传学。E-mail: hqling@genetics.ac.cn

刘毅，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向：分子遗传学。E-mail: yiliu609@outlook.com

10.16288/j.yczz.21-405

(责任编委: 储成才)