MCM2通过抑制p53信号通路促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

王翠玲，刘信燚，王亚会，张争，王治东，周钢桥,

研究报告

MCM2通过抑制p53信号通路促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

王翠玲1，刘信燚1，王亚会2，张争1，王治东3，周钢桥1,3

1. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，国家蛋白质科学中心，北京 102206 2. 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，国家蛋白质科学中心，北京 102206 3. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850

微小染色体维持蛋白2 (minichromosome maintenance protein 2, MCM2)的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。为探索基因对胆管癌细胞肿瘤生物学行为的影响及其潜在的作用机制，本研究首先采用cell counting kit-8 (CCK-8)、平板细胞克隆形成、Transwell和Invasion实验证实，可促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；流式细胞术检测结果显示，可加快细胞周期进程，抑制细胞凋亡。进一步通过对胆管癌组织RNA测序数据集的分析发现，基因与p53信号通路的激活显著负相关。采用实时定量PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting, WB)实验发现，在胆管癌细胞中可显著下调和的mRNA和蛋白表达水平，显著上调和的mRNA和蛋白表达水平。采用流式细胞术、qRT-PCR和WB实验进一步证实基因依赖于p53通路发挥影响胆管癌细胞周期和凋亡的功能。最后，通过分析的表达水平与胆管癌患者临床预后的相关性发现，在胆管癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且其高表达与患者的不良预后显著相关。综上所述，本研究初步揭示可能通过抑制p53信号通路促进胆管癌的发生发展，并提示的高表达与胆管癌的不良预后显著相关，为未来胆管癌新的临床诊治措施的研发提供了理论依据。

胆管癌；MCM2；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭；细胞周期；细胞凋亡；p53

微小染色体维持蛋白2 (minichromosome main­tenance protein 2, MCM2)是组成 MCM复合体的六种蛋白质之一。MCM复合物是一种稳定的异六聚体，在DNA复制过程中发挥重要的作用。在细胞周期的S期，细胞周期激酶激活MCM复合物，从而引发DNA复制的启动[8]。以往研究已发现，MCM2的异常与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如，显著促进口腔癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭；并且，MCM2在这些恶性肿瘤组织中显著高表达，并与较差的预后显著相关[9,10]。分子机制研究显示，MCM2可通过p53通路抑制卵巢癌细胞凋亡，从而增加卵巢癌细胞对卡铂的敏感性[11]。然而，迄今为止，MCM2在胆管癌发生发展中的作用尚未被报道。因此，本研究旨在探索 MCM2对胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡等肿瘤生物学行为的影响，并进一步探索其作用机制和临床相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人源胆管癌细胞系Huh28、RBE和人源胚肾细胞系HEK293T均来自于本实验室细胞库。

1.2 实验试剂

主要包括细胞培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)及细胞传代所用的0.25%胰蛋白酶(北京细工生物科技有限公司)；细胞培养用的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(北京百诺威生物科技有限公司)；siRNA 转染试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)；CCK-8 (cell counting kit-8,CK04)检测试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；mRNA逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green荧光定量试剂盒(美国Kapa Biosystem公司)；细胞凋亡检测试剂盒(eBioscience™ Annexin V Apo­ptosis Detection kit-APC)(美国赛默飞公司)；兔源二抗(1:2000; CW0102M, CWBIO)和小鼠源二抗(1:3000; CW0103M, CWBIO)(北京康为世纪生物有限公司)；GAPDH抗体(1:1000; 60004-1-Ig, Proteintech)，p53抗体(1:4000; 10442-1-AP, Proteintech)，BAX抗体(1:800; 50599-2-Ig, Proteintech)，BCL2抗体(1:1500; 12789-1-AP, Proteintech)，CCND1抗体(1:1000; 60186-1-Ig, Proteintech) (武汉三鹰生物技术有限公司)；MCM2 抗体(1:1500; No. 3619T, CST)(美国CST公司)；自行配制的细胞核染料碘化丙啶(propidium iodide, PI; 1 mg/mL)和磷酸盐缓冲液(phosphate buf­fer saline, PBS)等。

1.3 细胞系培养

HEK293T、Huh28和RBE细胞均使用含有10% FBS和1%青、链霉素双抗的DMEM进行培养，培养条件为：37℃，5%CO2，并保持一定的湿度。

1.4 慢病毒包装及靶细胞感染

将病毒包装质粒(pMD2.G, psPAX2)分别与目的质粒pLVX-Puro-Flag-和对照载体pLVX- Puro-Flag，按照质量1∶2∶3的比例共转染于HEK293T细胞中，6 h后更换为完全培养基继续培养，48 h后收集上清液，用0.45 μm滤器过滤，分装。然后，在Polybrene (5 μg/mL)介导下，使用收集的病毒上清液感染目的细胞Huh28和RBE，12 h后更换完全培养基，48 h后加入终浓度为500 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，将筛选出的细胞扩大培养。

1.5 siRNA转染

采用锐博riboFECT™ CP转染试剂进行siRNA转染。将siRNA、转染试剂共同孵育0～15 min后，滴加至目的细胞Huh28和RBE中，37℃、5%CO2培养48 h后用于后续实验。和的siRNA序列由锐博生物科技有限公司合成，序列为：si-Ctrl：5ʹ-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3ʹ；si--#1：5ʹ-GTCGCAGTTTCTCAAGTAT-3ʹ；si--#2：5ʹ-CTGTCATCCTAGCCAACCA-3ʹ；si-：5ʹ-GAA­GAAAATTTCCGCAAAA-3ʹ。

1.6 蛋白质提取及蛋白质免疫印迹(Western blotting, WB)实验

收集对照组和实验组细胞，用PBS洗2次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12,000 r/min离心10 min，转移上清至新的离心管中，按比例加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，得到细胞总蛋白样品。配制适宜浓度的SDS-PAGE胶，随后进行上样、电泳和转膜，转膜完毕后将含有目的蛋白的醋酸纤维膜置于含5% 脱脂乳的封闭液中，室温封闭1～2 h。4℃条件下孵育一抗过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，二抗室温孵育2 h，再用TBST洗3次，最后进行显影。

在矿体资源量双对数坐标图上（图3），大吨位矿体对应于较高的分维值(D3=1.22531)；小规模矿体对应于较低的分维值(D1= 0.01114)；中等规模的矿体中对应于分维值D2= 0.1160。与矿体的三个成矿阶段相对应。当D > 1时,说明矿床储量规模的分布相对比较集中，中间储量的矿床比较发育[3]。因此，肖家山矿区大吨位矿体有一部分尚未被发现，仍具有一定的找矿前景。

1.7 CCK-8细胞增殖实验

收集处于生长对数期的细胞，计数细胞后调整细胞密度，按每孔2000个细胞接种于96孔板，每组3个重复，细胞培养一定时间后加入含10% CCK-8试剂的无血清DMEM培养基，采用酶标仪在450 nm 处检测吸光度值，收集数据，根据记录的数据进行统计分析并绘制细胞生长曲线。

1.8 平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖

取对数生长期的细胞消化重悬，按照每孔1000个细胞接种至6孔板，每组3个重复，置于培养箱培养8～14 d后取出，使用甲醇固定15 min，0.5%结晶紫染色20 min，清洗晾干后对6孔板中的细胞克隆进行拍照、计数和统计分析。

1.9 细胞迁移和侵袭实验

对于迁移实验，将处于对数生长期的实验组和对照组细胞接种至6孔板中，置于培养箱中培养36 h。然后更换不含血清的DMEM培养基饥饿18 h，随后消化细胞，用不含血清的DMEM重悬并计数。在Transwell上室中铺7×104个细胞，在Transwell下室中加入500 μL含有20% FBS的DMEM，培养24～36 h后，取出小室，用PBS清洗1次，甲醇固定15 min，0.5%结晶紫染色20 min，洗去多余染液，小心擦拭小室内部未发生迁移的细胞并晾干，在显微镜下对穿过小室的细胞进行拍照计数。对于侵袭实验，使用加入Matrigel基质胶的Transwell小室，其余操作同迁移实验。

1.10 流式细胞术检测细胞周期

收集对照组和实验组细胞，PBS清洗2次，随后用 300 μL PBS 重悬后悬滴置700 μL预冷的无水乙醇中，–20℃固定，过夜。过夜后离心，用PBS清洗1次，将细胞置于含有200 μg/mL核糖核酸酶 A和1 mg/mL PI 的PBS中，室温避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测细胞DNA含量，采用ModFit 软件分析细胞周期数据。

1.11 流式细胞术检测细胞凋亡

取处于对数生长期的实验组和对照组细胞，以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养36 h。收集细胞，PBS洗2遍，加入200 μL PBS稀释的结合缓冲液，5 μL Annexin V-APC染色液，5 μL PI染色液重悬细胞，室温避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡，采用FlowJo软件分析数据。

1.12 RNA的提取及实时定量PCR实验

提取细胞总RNA，进行RNA逆转录反应。根据SYBR Green荧光定量试剂盒说明书进行实时定量PCR (quantitative real time polymerase chain reac­tion, qRT-PCR)实验。以肌动蛋白基因()为内参，使用2–∆∆Ct法对mRNA的定量结果进行归一化处理。所有PCR实验均进行熔解曲线分析，以排除非特异性扩增。PCR引物由华大基因公司合成，引物信息见表1。

1.13 通路富集分析

为探索在胆管癌发生、发展过程中的分子机制，本研究下载了国际癌症基因组图谱计划(the cancer genome atlas, TCGA)数据库中36例胆管癌(cholangiocarcinoma, CHOL)患者的mRNA测序数据(包括36个癌组织和9个癌旁组织)。根据癌组织中基因mRNA表达的中位数值(9.85)，将36例患者分为高表达组(≥9.85,= 18)和低表达组(<9.85,= 18)两组。使用NetworkAnalyst进行基因差异表达分析，共得到588个显著差异表达基因(显著性定义为：倍数变化[fold change] > 1.5,0.05)。进一步采用Enrichr，对上述588个基因进行KEGG和BioGarta通路富集分析，校正后< 0.05的通路被认为是显著富集的通路。此外，本研究采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)对高表达组和低表达组进行通路富集分析，使用MSigDB (7.4版本)中的信号通路，样本置换检验1000次，以FDR < 0.2作为差异显著性的评价标准。为了进一步验证通路富集分析结果，本项研究还下载高通量基因表达数据库(gene expression omnibus database, GEO)中30例胆管癌的mRNA测序数据(编号：GSE107943，包括30个癌组织和27个癌旁组织)。根据癌组织中基因mRNA表达的中值(8.54)，将30例病人分为高表达组(≥8.54,= 15)和低表达组(<8.54，= 15)两组，使用NetworkAnalyst进行基因差异表达分析，共得到768个显著差异表达的基因(显著性定义同上)，进一步采用Enrichr对差异表达基因进行通路富集分析。还采用GSEA对高表达组和低表达组进行通路富集分析。

表1 用于实时定量PCR实验的引物信息

F: 上游引物；R: 下游引物。

1.14 临床相关性分析

为探索基因在胆管癌组织中的异常表达情况及其与胆管癌病人预后的相关性，本研究分析了 TCGA数据库和GEO数据库(GSE107943)中胆管癌患者的mRNA测序数据和临床资料数据。分析了这两个数据集中MCM2在癌和癌旁组织间的差异表达情况，进一步根据TCGA数据集的胆管癌组织中基因mRNA表达的中值(9.85)分为高表达(≥9.85,= 18)和低表达(<9.85,= 18)两组，分析了的表达与患者总体生存期和无病生存期的相关性。

1.15 统计学方法

采用SPSS 16.0和GraphPad(v6)进行统计学分析。实验组间数据的比较采用Student’s检验。癌和癌旁组织间基因的mRNA差异表达分析采用GraphPad软件(v6)的Student’s检验。基因 mRNA表达值与临床病理信息的相关性分析使用GraphPad软件(v6)的2检验。Kaplan-Meier法用于绘制生存曲线，两组间生存率的差异分析采用GraphPad软件(v6)中的Log-rank检验。所有统计学检验中，< 0.05视为具有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 敲低MCM2可显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

采用特异性靶向基因的siRNA转染Huh28和RBE细胞，获得瞬时敲低的细胞株。随后，采用CCK-8和平板细胞克隆形成实验，探索敲低对胆管癌细胞增殖能力的影响。结果显示，敲低能够显著抑制Huh28和RBE细胞的增殖(< 0.001；图1：A和B)。本研究还采用Transwell和Invasion实验，探索敲低对胆管癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示，敲低能够显著抑制Huh28和RBE细胞的迁移和侵袭能力(< 0.001；图1C)。

2.2 过表达MCM2可显著促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

本研究采用pLVX-Puro-Flag-质粒构建了稳定过表达的Huh28和RBE细胞株。结果显示，过表达能够显著促进Huh28和RBE细胞的增殖能力(< 0.001；图2：A和B)。此外，过表达可显著促进胆管癌细胞的迁移和侵袭能力(< 0.001；图2C)。

2.3 MCM2可显著促进胆管癌细胞的周期进程

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期紊乱是肿瘤发生发展的重要生物学机制之一[12,13]。为了探索的异常表达对胆管癌细胞周期的影响，本研究采用流式细胞术，观察在Huh28和RBE中扰动基因后细胞周期的变化。结果显示，敲低后，处于G1期的Huh28和RBE细胞数量显著增加，处于S期的细胞数量显著减少，而处于G2/M期的细胞数量无显著改变(< 0.001；图3A)。反之，过表达能显著减少处于G1期的Huh28和RBE细胞数量，增加S期的细胞数量，而对G2/M期的细胞数量无显著影响(< 0.01；图3B)。以上结果提示，能够显著促进胆管癌细胞的周期进程。

图1 敲低MCM2后可显著抑制胆管癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力

A：敲低可显著抑制Huh28细胞的增殖能力；B：敲低可显著抑制RBE细胞的增殖能力；C：敲低可显著抑制Huh28和RBE细胞的迁移和侵袭能力。采用双侧Student’s检验，**：< 0.01；***：< 0.001。

2.4 MCM2可显著抑制胆管癌细胞的凋亡

肿瘤细胞凋亡异常也是肿瘤发生发展的重要生物学机制之一[14]。为了探索的异常表达对胆管癌细胞凋亡的影响，采用AnnexinⅤ-APC/PI 染色法，检测扰动基因后对Huh28和RBE细胞凋亡的影响。结果显示，敲低后可显著促进Huh28和RBE细胞的凋亡(< 0.01；图4A)；而过表达后则显著抑制Huh28和RBE细胞的凋亡(< 0.05；图4B)。

2.5 MCM2影响胆管癌细胞的p53信号通路

以往的研究发现，在肝癌中，基因可通过抑制p53信号通路而发挥癌基因的功能[15]。为了验证在胆管癌中是否也通过调控p53信号通路而发挥癌基因的功能，本团队分别从TCGA数据库(CHOL,= 36)和GEO数据库中(GSE107943,= 30)下载了胆管癌组织的mRNA测序数据集，并分别根据对应数据集癌组织基因mRNA表达水平的中位数值，将样本分为高表达组和低表达组。随后，采用NetworkAnalyst[16]软件，筛选两组间显著差异表达的基因(fold change > 1.5,< 0.05)。由此，本研究在TCGA数据集和GSE107943数据集中，分别得到588个和768个显著差异表达的基因。进一步，采用Enrichr[17]分别对上述两个差异表达基因集进行通路富集分析，结果均显示，这些差异表达基因显著富集于p53信号通路(图5A)。基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)结果也显示，的表达与p53通路的活性显著负相关(图5B)。总之，通过上述生物信息学分析，初步提示在胆管癌细胞中显著抑制p53信号通路。

图2 过表达MCM2可显著促进胆管癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力

A：过表达显著促进Huh28细胞的增殖能力；B：过表达显著促进RBE细胞的增殖能力；C：过表达显著促进Huh28和RBE细胞的迁移和侵袭能力。采用双侧Student’s检验，：< 0.001。

2.6 MCM2通过抑制p53信号通路而发挥癌基因的功能

p53通路是重要的抑癌信号通路，该通路可通过调控细胞周期进程和/或细胞凋亡等多个重要的生物学进程来发挥抑癌作用[18]。前文通过生物信息学分析，已初步提示可调控p53信号通路。随后，进一步在mRNA和蛋白水平验证是否影响p53及其下游相关靶分子的表达。qRT-PCR和WB结果显示，敲低后，、促凋亡因子的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，而凋亡抑制因子、细胞周期蛋白D1()的mRNA和蛋白表达水平均显著下调(< 0.01；图6：A和B)。反之，过表达可显著下调和的表达水平，上调和的表达水平(< 0.05；图6：C和D)。上述结果初步揭示，基因在胆管癌细胞中抑制p53通路。

图3 MCM2可显著促进胆管癌细胞的周期进程

A：敲低使Huh28和RBE细胞发生S期阻滞；B：过表达显著促进Huh28和RBE细胞的周期进程。PI：碘化丙啶(propidium iodide)。采用双侧Student’s检验，**：< 0.01；***：< 0.001。

2.7 MCM2通过抑制p53信号通路而影响胆管癌细胞的周期和凋亡

上述实验已证明了可促进胆管癌细胞的细胞周期进程，并抑制胆管癌细胞的凋亡，同时证实了能够抑制及其下游相关靶分子的表达。为了进一步证明是否依赖于p53发挥促癌功能，首先采用特异性靶向和的siRNA转染Huh28和RBE细胞，获得同时敲低和的细胞株。通过qRT-PCR和WB实验，在Huh28和RBE细胞中，验证及其下游相关靶分子的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，在敲低的情况下，敲低对及其下游相关靶分子、、的mRNA和蛋白表达水平均无显著影响(< 0.05；图7A)。同时，采用流式细胞术检测敲低后，进一步敲低对Huh28和RBE细胞的周期和凋亡的影响。结果显示，在敲低的情况下，敲低对胆管癌细胞的周期和凋亡均无显著影响(< 0.01；图7：B和C)。上述结果初步提示，依赖于p53信号通路而发挥影响胆管癌细胞周期和凋亡的功能。

图4 MCM2显著抑制胆管癌细胞凋亡

A：敲低显著促进Huh28和RBE细胞凋亡；B：过表达显著抑制Huh28和RBE细胞凋亡。PI：碘化丙啶(propidium iodide)；Annexin V：膜联蛋白V。采用双侧Student’s检验，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

2.8 MCM2在胆管癌组织中高表达且与患者的不良预后显著相关

为了探索的异常表达与胆管癌病人临床预后的相关性，本项研究下载了TCGA数据库(CHOL：癌组织= 36，癌旁组织= 9)和GEO数据库(GSE107943：癌组织= 30，癌旁组织= 27)中胆管癌患者的RNA测序数据和/或临床信息。通过差异表达分析，发现在胆管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(< 0.0001；图8A)。回顾性分析显示，癌组织中的表达水平与其年龄、性别和患者的病理分期无显著相关性(表2)。进一步的生存分析显示，高表达组的胆管癌患者其总体生存率和无病生存率均低于低表达组(边缘统计学意义，= 0.086；图8B)。上述结果进一步提示在胆管癌中可能发挥癌基因的功能，并且提示可能是胆管癌不良预后的候选标志物。

3 讨论

胆管癌是起源于胆管上皮细胞、具有高度侵袭性的恶性肿瘤[19]。近年来，胆管癌的发病率和死亡率均呈逐渐上升趋势[3]。鉴定胆管癌发生发展的相关基因，阐明癌症的发病机制，将为胆管癌的防治提供理论依据。本研究在胆管癌细胞系中初步探索了基因对胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的影响，并通过初步的生物信息学分析和功能实验，提示了该基因可通过p53信号通路促进胆管癌的发生发展，且其高表达与胆管癌患者的不良预后显著相关。

图5 MCM2基因可显著抑制p53信号转导通路

A：从TCGA(TCGA-CHOL,= 36)和GEO数据库中(GSE107943,= 30)获取胆管癌的RNA测序数据集，并根据对应数据集的癌组织中基因mRNA表达水平的中位数值分为高表达和低表达两组。随后，采用NetworkAnalyst软件在TCGA和GSE107943数据集中筛选高、低表达两组间显著差异表达的基因(fold change > 1.5,< 0.05)，分别得到588个和768个显著差异表达的基因。进一步采用Enrichr对显著差异表达的基因集进行KEGG和BioCarta通路富集分析，结果均提示显著富集于p53信号通路。B：GSEA富集分析p53的一系列参与调控细胞凋亡和细胞周期的靶基因，p53下游负向调控细胞衰老、凋亡和细胞周期的靶基因显著富集于正相关区域(靠左边)，提示促进抑制衰老、凋亡和细胞周期阻滞相关基因的表达。TCGA：际癌症基因组图谱计划(the cancer genome atlas)；GEO：高通量基因表达数据库(gene expression omnibus database)；GSEA：基因集富集分析(gene set enrichment analysis)；NES：标准化富集分数(normalized enrichment score)。< 0.05为显著富集。

图6 MCM2对p53及其相关靶基因的mRNA和蛋白表达水平的影响

A：敲低上调Huh28细胞的和的mRNA和蛋白表达水平，下调和的mRNA和蛋白表达水平；B：敲低上调RBE细胞的和的mRNA和蛋白表达水平，下调和的mRNA和蛋白表达水平；C：过表达下调Huh28细胞的和的mRNA和蛋白表达水平，上调和的mRNA和蛋白表达水平；D：过表达下调RBE细胞的和的mRNA和蛋白表达水平，上调和的mRNA和蛋白表达水平。采用双侧Student’s检验，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

MCM2是MCM复合物成员之一。已有研究发现，MCM2可调节细胞增殖、分化、凋亡和衰老过程，当MCM2表达下调，细胞的增殖能力显著下降[20]。MCMs在复制起始过程中具有解旋酶活性，可通过调控细胞周期内复制起始点发挥作用[21]。已有研究报道，MCM蛋白可以通过影响多种细胞功能、DNA合成和转录来促进肿瘤的发生发展[22]。例如，基因参与肺癌细胞的增殖、迁移和细胞周期等过程，且的高表达与肺癌患者的较低生存率显著相关[23]。肝癌组织的蛋白质组学分析也发现，在肝癌组织中显著高表达，敲低后可显著抑制CCND依赖性激酶途径，从而引起HepG2细胞周期发生S期阻滞、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡[24]。然而，在胆管癌发生发展中的作用及机制一直未见报道。本项研究发现能够显著促进胆管癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力；并且，能显著促进胆管癌细胞系的细胞周期进程、抑制细胞凋亡。这些结果均提示在胆管癌中可能发挥癌基因的功能。

本研究发现，在胆管癌细胞中，MCM2能够显著下调p53和BAX的表达水平，上调BCL2和CCND1的表达，且MCM2依赖于p53通路发挥癌基因的功能。那么，MCM2可能通过何种途径抑制p53通路？已知MCM复合物是一种DNA解旋酶，在DNA复制过程中发挥重要的作用。越来越多的研究提示，MCM复合物还与其他生物学过程密切相关[25]。例如，MCM复合体能够与RNA聚合酶II或特定的转录因子发生相互作用，从而在基因转录调节过程中发挥功能[26]。其中，MCM2已被报道能与RNA聚合酶II结合而发挥转录调控的功能[27,28]。由此，本团队推测，MCM2可能通过上述途径在转录水平抑制p53通路。有趣的是，已有研究报道，在低氧条件下的多种细胞类型中，MCM蛋白能够直接与转录因子HIF-1α结合，并通过增强HIF-1α的蛋白酶体降解而负向调控HIF-1的转录活性[29]。已知HIF-1α能够直接与p53基因的启动子区域结合，在转录水平上调的表达[30]。综上所述，MCM2可能通过与其他转录因子相互作用形成转录调控复合物，从而在转录水平影响的表达。但针对MCM2与p53通路间的具体调控机制，还需进一步的实验研究。

图7 MCM2依赖于p53通路影响胆管癌细胞的周期和凋亡

A：Huh28和RBE细胞中，在敲低的情况下，敲低对、和的mRNA和蛋白表达无影响；B：Huh28和RBE细胞中，在敲低的情况下，敲低对细胞周期进程无显著影响；C：Huh28和RBE细胞中，敲低的情况下，敲低，不影响细胞凋亡。PI：碘化丙啶(propidium iodide)；Annexin V：膜联蛋白V。采用双侧Student’s检验，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

图8 MCM2的异常表达及其与胆管癌患者总体生存率和无病生存率的相关性

A：在胆管癌组织中的表达显著高于癌旁组织；B：生存曲线图显示与低表达的胆管癌患者相比，高表达的胆管癌患者具有更低的总体生存率(左)和无病生存率(右)。HR：风险比(hazard ratio)；差异表达分析采用GraphPad(v6)的Student’s检验；Kaplan-Meier法用于绘制生存曲线，两组间生存率的差异分析采用GraphPad(v6)的Log-rank检验。< 0.05为有显著性差异。

表2 胆管癌组织中MCM2基因的mRNA表达水平与临床特征和社会人口学因素的相关性分析

根据美国癌症联合会和国际抗癌联盟的TNM (tumor-node-metastasis)分期，可将肿瘤分为I、II、III和IV期；值采用2检验计算，< 0.05为差异具有显著性意义。

总之，本研究初步探索了在胆管癌细胞中的功能和作用机制，初步提示其可能通过抑制p53通路而发挥癌基因的作用，并且评价了其作为胆管癌患者预后标志物的潜在价值，为未来胆管癌新的临床诊治措施的研发提供了理论依据。

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MCM2 promotes the proliferation, migration and invasion of cholangiocarcinoma cells by reducing the p53 signaling pathway

Cuiling Wang1, Xinyi Liu1, Yahui Wang2, Zheng Zhang1, Zhidong Wang3, Gangqiao Zhou1,3

The abnormal expressions of minichromosome maintenance protein 2 (MCM2) are closely related to the development of various kinds of cancers. We aimed to explore the functions and potential molecular mechanisms ofgene in cholangiocarcinoma (CCA) cell lines (Huh28 and RBE). First, the cell counting kit-8 (CCK-8), plate clone formation, transwell and invasion assays showed thatpromotes the proliferation, migration and invasion of CCA cells. Flow cytometry assays showed thatsignificantly promotes the cell cycle, and inhibits the apoptosis of CCA cells. Further, by analyzing the RNA sequencing data of cholangiocarcinoma, we found thatgene is significantly negatively correlated with p53 signaling pathway. Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting (WB) assays confirmed thatin CCA cells significantly down-regulated the mRNA and protein expression levels ofand, and up-regulated the mRNA and protein expression levels ofand. Flow cytometry, qRT-PCR and WB assays confirmed thatpromotes CCA through p53 pathway. Finally, we found thatis up-regulated in CCA tissues compared to the matched non-tumor cholangiocarcinoma tissues, and the high expressions ofare significantly associated with the poor clinical outcomes of CCA patients. In conclusion, this study revealed thatpromotes the development of CCA by reducing the p53 pathway, and its high expression levels predict poor prognosis in CCA patients. These results provide a theoretical basis for the development of new clinical diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma in the future.

cholangiocarcinoma; MCM2; proliferation; migration; invasion; cell cycle; apoptosis; p53

2021-12-20;

2022-01-18;

2022-01-29

国家自然科学基金项目(编号：31771397)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31771397)]

王翠玲，在读硕士研究生，专业方向：放射医学。E-mail: 1376544094@qq.com

周钢桥，博士，研究员，研究方向：医学遗传学与基因组学。E-mail: zhougq114@126.com

10.16288/j.yczz.21-426

(责任编委: 谢小冬)