结肠癌转移相关基因1、分离酶抑制蛋白在乳腺癌进展中的作用

王 丽，郭宏艳，何利珍 ，张云霏，张 虹，聂登梅

(1.西北民族大学附属医院,甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000；2.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510000)

近年来随着国内肿瘤发病率和死亡率的不断上升，乳腺癌已取代肺癌，成为全球第一大癌，严重威胁着女性的健康，而且，关于进展期乳腺癌的侵袭性和治疗的研究一直以来都是研究的热点。结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是一个与结肠癌密切相关的基因，也是肝细胞生长因子(HGF)/c-Met信号转导通路的重要调节因子[1]；分离酶抑制蛋白(Securin)通过抑制分离酶的活化，从而抑制染色体的过早分离，Securin的过表达可导致细胞的非整倍性，进而引起体内基因转化和体外肿瘤形成[2]。已有研究发现MACC1和Securin在消化道癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达[3，4]，发现MACC1和Securin与肿瘤的浸润、转移具有相关性，但是两者在乳腺癌中的研究却相对缺乏，本研究检测乳腺浸润性导管癌不同病变组织中MACC1和Securin的表达情况，并探究二者在乳腺癌中的表达有无相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集甘肃省第二人民医院病理科2015年1月至2020年6月乳腺活检及乳腺癌根治手术标本，均为女性患者，年龄25～78岁，中位47岁。纳入标准：术前均未接受化疗、放疗及其它辅助治疗。排除标准：术前曾接受放化疗或其他肿瘤的针对性治疗者，并患有其他系统严重疾病者。其中乳腺导管普通增生(usual ductal hyperplasia，UDH)20例、导管异型增生(atypical ductal hyperplasia，ADH)20例、导管原位癌(ductal carcinama in situ，DCIS)15例、无淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌26例、伴有淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌29例。其中20例UDH及20例ADH取自乳腺局部切除的标本，乳腺癌病例取自根治标本。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其它辅助治疗。由两位副主任以上病理医师对病理进行诊断、分类和分级。液氮冷冻组织用于mRNA检测，石蜡包埋组织用于免疫组化检测。

1.2 方法

1.2.1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) Trizol法(Trizol试剂购自美国Invitrogen公司)提取各液氮冷冻乳腺组织总RNA，应用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，按照cDNA第一链合成试剂盒(购自加拿大Formentas公司)说明书所述方法，将总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。MACCl基因的上游引物序列为5′-GCTTGGGCTCACTTCCACAA-3′，下游引物序列为5′-ACCACGAAGGGTGAAAGCAT-3′，扩增产物长度为201bp；Securin基因的上游引物序列为5′-GACTGTTCCGCTGTTTAGCTC-3′，下游引物序列为5′-GTGGGGCATCGAACGTTTTG-3′，扩增产物长度为295bp；内参照GAPDH上游引物序列为5′-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物序列为5′-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′，扩增产物长度为313 bp，以上引物均由生工生物(上海)工程技术有限公司合成。PCR反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后，72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.2免疫组织化学 手术标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，4～6 μm厚连续切片，常规脱蜡水化。浸入柠檬酸盐修复液中热抗原修复3 min，自然冷却至室温，放入PBS缓冲液中震荡并冲洗3次，3 min/次。滴加3% H2O2孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，3 min/次。滴加10%正常山羊血清，室温孵育10 min，消除非特异性染色。滴加一抗(1∶200 MACC1兔抗人多克隆抗体(购自美国Sigma公司)；Securin兔多克隆抗体(购自Santa Crue(USA)公司))4 ℃过夜，次日PBS冲洗3次，3 min/次。滴加聚合物辅助剂，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，3 min/次。滴加辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体(试剂购自福州迈新生物技术有限公司)，室温孵育30 min，PBS冲洗3次，3 min/次。DAB显色(试剂购自福州迈新生物技术有限公司)，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。以PBS缓冲液置换一抗作为阴性对照，用已知MACC1阳性的组织作为阳性对照。

1.3 结果判定MACC1蛋白产物主要表达于胞浆，少数可表达在细胞核，胞浆或胞核染色呈黄色或棕褐色者视为阳性细胞； Securin蛋白产物主要表达于胞浆，胞浆染色呈黄色或棕褐色者视为阳性细胞，根据阳性范围和阳性强度综合分析。阳性细胞数<5%记为0分，5%～30%记为1分；30%～60%记为2分；≥60%记为3分。无着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。两项评分结果相加后分为4级：0～1分为阴性(-)；2分为弱阳性(+)；3～4分为中度阳性(++)；5～6分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。组间率的比较采用χ2检验或Fisher精确检验；相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同乳腺组织中MACC1与Securin蛋白的表达情况MACC1蛋白主要表达于乳腺癌的癌细胞，定位于胞浆，但少数也可表达在细胞核，而在乳腺增生组织中几乎不表达(见图1)，MACC1在UDH、ADH、DCIS、IDC阳性表达率分别为0%、0%、13.33%、81.82%；Securin蛋白主要表达于乳腺癌的癌细胞，定位于胞浆，而在乳腺增生组织中几乎不表达(见图2)。

图1 不同乳腺组织中macc1的表达 (免疫组化envision两步法) a： udh组织中阴性表达(×100)；b: dcis组织中弱阳性表达(×200)；c: idc淋巴结转移阳性组织中强阳性(2+)表达(×200)；d: idc淋巴结转移阳性组织中强阳性(3+)表达(×200)

图2 不同乳腺组织中Securin的表达(免疫组化染色EnVision两步法) a：UDH组织中阴性表达(×100)；b: DCIS组织中弱阳性表达(×200)；c: IDC淋巴结转移阳性组织中强阳性表达(×200)

2.2 不同临床病理参数中MACC1与Securin蛋白的表达比较不同肿瘤的直径、组织学分级、淋巴结转移、乳腺组织类型中MACC1与Securin蛋白的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床病理参数中MACC1与Securin蛋白的表达比较 (n)

2.3 不同乳腺组织中MACC1 mRNA、Securin mRNA的表达情况MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺组织中的表达比较，差异有统计学意义 (P<0.05)。其中MACC1 mRNA、Securin mRNA分别在乳腺增生组与癌组中的表达(χ2=45.414，48.894)；在原位癌组与浸润癌组中的表达(χ2=105.803，111.892)、淋巴结转移阴性组与阳性组中的表达比较(χ2=98.868，109.247)，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表3。RT-PCR检测MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺组织中的表达情况见图3。

表3 不同乳腺组织中MACC-1 mRNA、Securin mRNA的表达情况 [n(%)]

2.4 乳腺癌组织中MACC1 与Securin的相关性分析在70例乳腺癌组织中MACC1和Securin的表达相关(r=0.785；r=0.642，均P<0.001)，见表4、表5。

表4 Securin mRNA与MACC1 mRNA的相关性

表5 MACC1蛋白与Securin蛋白表达的相关性

3 讨论

乳腺癌已成为严重危害女性健康的“头号杀手”，其发病率和死亡率均高居首位。虽然目前已有手术切除、放疗、化疗、内分泌治疗及免疫治疗等多种有效的治疗手段使得乳腺癌患者的生存情况得到了极大的改善，但部分患者因复发、转移，预后仍然较差。因此，与乳腺癌进展相关的分子基础和信号途径的研究对于该疾病的早发现、早诊断、早治疗有着重要的指导性作用，即规范和精准地治疗乳腺癌对提高患者的生存率意义重大。

研究表明，正常组织中HGF/c-Met信号转导通路在胚胎发育和组织损伤修复中起重要作用[5]。此外，HGF/c-Met信号通路在细胞增殖、迁徙、血管生成、上皮细胞间质化过程中也起重要作用, 但是它的异常激活与恶性肿瘤的发生，特别是恶性肿瘤的浸润和转移密切相关[6]。据文献报道MACC1可以在转录水平增强c-Met的表达，使HGF/c-Met信号转导通路异常激活，从而促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移[7]。张巍[8]的研究表明，MACC1可以增强肿瘤细胞的迁移能力，增加胃癌细胞淋巴结转移和浸润能力。此外，熊晶等[9]的研究表明，MACC1蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且此蛋白的表达与乳腺癌患者组织学分级、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤复发显著相关；MACC1高表达的患者总生存期和无进展生存期均较短；MACC1可能参与了乳腺癌的发生、发展，在乳腺癌预后评估中具有一定的价值。本课题研究显示，MACC1在乳腺增生组织中不表达或低表达，而在乳腺导管原位癌中及未发生淋巴结转移的乳腺浸润癌中高表达，在淋巴结转移的乳腺癌组织中的表达更高、更明显，与以上研究结果相符。此外，本课题从乳腺增生组织到乳腺癌的病变进展组织中，可以看到MACC1不论是分子水平的mRNA表达还是免疫组化的蛋白表达均呈现出梯度递增的表达状态，从而提示MACC1在乳腺癌的侵袭和转移过程中起到了重要作用，因此推测MACC1对判断乳腺癌的进展具有重要意义，且有可能成为潜在的靶点，为乳腺癌的治疗提供一些新思路。

正常组织中Securin在睾丸与胸腺中表达水平较高，而在胎盘、结肠、小肠、大脑、胰腺中低水平表达。此外，Securin还参与了细胞的有丝分裂、凋亡以及DNA修复等关键的细胞活动[10]，在有丝分裂后期，Securin蛋白N末端的毁坏盒与后期促进复合物连接，并在多种酶类参与下被泛素化降解，从而使分离酶活化[2]。Securin的高表达可以诱导细胞的多倍体性，而Securin的缺失则可引起基因的不稳定性。有研究发现，Securin的在多种内分泌腺体及腺体相关恶性肿瘤中表达异常，如脑垂体瘤、甲状腺癌、卵巢癌、结肠癌等，并且还与肿瘤的恶性程度相关[11]。然而Securin在乳腺癌中的研究相对较少，为了探索它在乳腺癌中的表达以及是否和乳腺癌的转移、侵袭相关，我们在Selam等[12]研究基础上，增加了导管原位癌组织样本，相继研究不同乳腺组织中Securin在分子及蛋白水平的表达情况，结果显示，Securin在乳腺增生组织中不表达或低表达，在乳腺导管原位癌中及未发生淋巴结转移的乳腺浸润癌中异常高表达，而在已发生淋巴结转移的乳腺癌组织中的表达更高、更明显。因此Securin在乳腺癌的病变进展组织中无论是在分子水平还是蛋白水平都呈现出梯度递增的表达状态。此外，吴秋等[13]研究也显示，Securin与乳腺癌的发生、发展密切相关。Gurvits等[14]研究表明，securin的表达可作为乳腺癌患者强有力且独立的预后指标，尤其是对在生物学和临床上具有挑战性的三阴性乳腺癌。因此，基于以上研究结果我们推测Securin也有可能是一种潜在的预测乳腺癌进展的新型标记物。

综上所述，MACC1与Securin虽非同一通路、同一作用机制的相关因子，但是在乳腺癌的发生发展中，本研究发现MACC1与Securin蛋白的表达在不同肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移之间的表达差异具有统计学意义，且MACC1与Securin在乳腺癌中基因及蛋白水平的表达相关。因此，在乳腺癌组织中联合检测MACC1与Securin的表达情况，可以给我们提供重要的预测信号，了解乳腺癌患者疾病的进展情况，也有望为乳腺癌的分子靶向治疗提供新的靶点。