环氧化酶2和金属基质蛋白酶9在胃肠神经内分泌肿瘤中的表达及与临床病理特征的关系

余 松，侯能易，严 力，王 康，潘 燕，赵应涛，王 越，曹钦兴，谢 伟，旦真甲，庞明辉,,c

(1.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000； 2. 四川省医学科学院·四川省人民医院 a.胃肠外科，b.消化内科，c.老年综合外科，四川 成都 610072；3.电子科技大学医学院，四川 成都 611731)

神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasms，NENs)可出现在机体多个部位，其发病率也呈上升趋势[1]。大多数肿瘤生长缓慢，多发病隐匿，临床表现不典型，常常于体检时发现。因其具有较高的恶性潜能，在初次诊断时约有25%发生远处转移[2]，远处转移患者的中位生存期约为2～5年[3]。因此，探索早期诊断指标、预后指标仍然是NENs防治不可忽视的环节。环氧化酶2(cycloxygenase-2，COX-2)是一种诱导性蛋白酶，在多种实体性肿瘤中检测到COX-2及其代谢产物前列腺素E2(PGE2)的表达量升高[4]，提示其在肿瘤形成过程中有着一定的促进作用[5～7]，并在肿瘤周围微环境中具有炎症调节的作用。MMP-9可参与细胞基底膜的修复与重建、组织修复等，与多种蛋白一起完成许多重要的生物合成过程。在胰腺癌、肺癌、肝癌等恶性程度高的肿瘤中检测到MMP-9的表达量升高[8～10]，进一步研究发现其对肿瘤负荷、分期评估以及预后预测的评估具有指导作用。COX-2、MMP-9与胃肠神经内分泌肿瘤(gastrointestinal neuroendocrine neoplasms，GI-NENs)发生发展及其预后的关系尚有待进一步研究。本研究采用免疫组化的方法检测175例GI-NENs患者中COX-2、MMP-9的表达情况，分析其临床病理资料及生存数据，探讨COX-2、MMP-9在GI-NENs诊治中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性收集2016年11月至2020年8月经四川省人民医院诊治的175例GI-NENs患者的临床病理资料。所有患者均经内镜或者手术病理诊断为神经内分泌肿瘤，未行术前放化疗等；病理组织均来自本院病理科的石蜡切片。根据病理的增殖程度及分化程度，分为NET G1 110例、NET G2 25例、NET G3 3例、NEC 21例和MiNEN 16例。分级标准参照2019年世界卫生组织(WHO)消化系统肿瘤分类[11]。

1.2 方法石蜡包埋的肿瘤组织切片，经脱蜡，酒精梯度水化处理，柠檬酸盐缓冲液(0.01M pH 6.0)进行抗原修复处理，山羊血清封闭，一抗孵育(COX2兔抗人单克隆抗体，1∶100(浓度)，ZA-0515)，4 ℃过夜，添加二抗(山羊抗兔工作液，SP-9001)，37 ℃ 30 min，DAB显色试剂显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。

1.3 免疫组织化结果判读经免疫组化处理好的切片先在100倍的显微镜下观察总体染色情况，然后在400倍显微图像下采集3个视野。图像采集后，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测算每个视野下的光密度(integrated optical density，IOD)和面积，再测算每个视野下的平均光密度(Mean density，MD)，再得出3个视野下图像的MD的平均值，由此得出每例样本中COX-2、MMP-9的平均的相对表达量。

1.4 随访患者的联系方式通过病案首页、住院患者随访群等方式查询到，通过电话、微信、门诊随访等方式进行随访，随访时间截至2021年6月。从疾病初次确诊时间至当前随访或患者死亡的时间定义为总生存时间。

1.5 统计学方法应用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。Kaplan-Meier生存曲线、Cox回归进行生存分析；组间生存分析比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃肠神经内分泌肿瘤切片中MMP、COX-2的表达情况COX-2(图1a～e)、MMP-9(图2a～d)主要在细胞质及细胞间质表达，染色黄色或棕黄色细胞代表阳性，染色蓝色细胞代表阴性，底物呈现白色。

图1 COX-2在GI-NENs中的表达情况 (免疫组化染色×400)a:NET-G1 b:NET-G2 c:NET-G3 d:NEC e:MiNEN

图2 MMP-9在GI-NENs中的表达情况 (免疫组化染色×400) a:NET-G1 b:NET-G2 c:NEC d:MiNEN

2.2 不同临床病理特征GI-NENs患者COX-2的表达比较不同肿瘤位置、肿瘤最大直径、TNM分期、病理分期、是否远处转移及淋巴转移的患者COX-2表达量差异有统计学意义(P<0.05)；性别、年龄与其COX-2的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征GI-NENs患者COX-2的表达比较

2.3 不同临床病理特征GI-NENs患者MMP-9的表达比较60例GI-NENs患者MMP-9的表达在性别、年龄、肿瘤直径大小、位置、TNM分期、是否远处转移以及是否淋巴结转移方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征GI-NENs患者MMP-9的表达比较

2.4 COX-2表达情况与GI-NENs患者生存的关系

175例GI-NENs患者的随访时间为1～53个月，中位随访时间21月。其中GI-NETs、NEC和MiNEN的中位生存时间分别是23、9和18月。利用Kaplan-Meier行单因素生存分析发现，TNM分期、病理分级、淋巴结转移以及远处转移与生存预后较差相关(P<0.001)(图3 a～d)。进一步多因素Cox回归分析，提示病理分级、淋巴结转移及远处转移是患者生存预后差的因素(见表3)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示高表达COX-2患者生存情况明显较低表达患者差，差异有统计学意义(P<0.001)(图3e)。

图3 175例 GI-NENs患者的生存分析 a:病理分级; b:TNM分期; c:有无淋巴结转移; d:有无远处转移； e：不同COX-2表达情况下的生存分析

表3 GI-NENs患者总生存率的COX多因素分析

3 讨论

NENs生长缓慢，但生物学行为不一，约有1/4在初次诊断发生转移，转移灶多位于肝脏[12]。大部分GI-NETs的发现主要依靠胃肠镜筛查，并且预后较好；然而，NEC和MiNEN其恶性程度较高，易发生远处转移，总体预后较NET差。近年来随着临床医师的重视，更多的患者被发现，但其侵袭机制以及预后因素的研究较少，寻找有效的治疗靶点以及精准的预后预测因素，对GI-NENs的诊疗有着重要的意义。

MMP-9是一种金属基质蛋白酶。国内学者发现，结直肠癌中MMP-9的表达量上调，与肿瘤的分期和淋巴转移相关，提示可能参与肿瘤的侵袭、经淋巴管转移过程[13]。同样在胰腺癌、肺癌以及肝癌组织中也检测到MMP-9的高表达[8～10]。本研究中发现，MMP-9在GI-NENs的表达，与肿瘤病理分级、肿瘤部位、TNM分期、远处以及淋巴转移等因素均无相关性。这与大部分MMP-9与肿瘤的关系研究中有一定差异，分析原因可能是NENs高度的异质性是主要原因，其次样本量不足，NET病理分级中缺少NET-G3的患者，样本不具有代表性，可能也是其中原因之一。

COX-2是机体合成前列腺素过程中的诱导性限速酶[14]，基因位于1号染色体q25.2～25.3，正常生理状态下的组织中很少表达[15]。有研究发现在肺癌、大肠癌、胰腺癌以及乳腺癌等肿瘤组织中检测到COX-2表达量增加[5，7，16]。深入研究发现，COX-2可通过影响生长周期、促进血管生长、破坏免疫细胞等机制，直接或间接地促进肿瘤的发生发展。同时在肿瘤组织的基因检测中发现COX-2是肿瘤肝脏转移、淋巴转移、骨转移以及脑转移的关键转移进展基因之一[17]。本研究检测到GI-NENs不同病理分级中COX-2表达有差异，在GI-NETs中，分级越高，表达量也升高，可能提示与肿瘤的进展有关系。同时，还发现COX-2在肿瘤分期晚、淋巴转移的肿瘤组织中表达高，生存分析提示高表达COX-2的患者其生存差。

在受到细胞内外多种因素影响下，如细胞因子、癌基因、内皮素等，COX-2可选择性表达上调。在生成前列腺素E-2(PGE-2)过程中，会产生大量氧自由基、活性氧，这些物质通过过氧化反应催化前致癌物质生成多环芳烃类以及黄曲霉等多种致癌物质，直接致使遗传信息的损害，造成细胞抑癌作用失调，这可能是COX-2促进肿瘤发生的一种机制。在胰腺癌细胞中发现，选择性COX-2抑制剂可使COX-2表达上调的癌细胞侵袭性显著降低，提示COX-2表达的上调可降低钙粘蛋白活性从而降低细胞间粘附反应，肿瘤细胞的浸润能力得到加强，有利于肿瘤细胞穿过胞外基质，更有机会发生远处转移[16]。本研究结果显示，有淋巴转移、有远处转移的GI-NENs中，COX-2表达量高于阴性组，可见在GI-NENs的侵袭转移过程中发挥一定作用，但其具体参与肿瘤转移途径中的机制有待后续研究。此外，COX-2还能通过激活HER-2酪氨酸激酶受体，促进肿瘤组织中高表达VEGF，参与肿瘤组织中血管的生长以及肿瘤向远处转移等过程[18]。本研究同样发现，COX-2在TNM分期较晚肿瘤中高表达，提示其参与了GI-NENs的发展侵袭。PGE2同样也参与了肿瘤的侵袭及转移。PGE2可促进肿瘤血管的生成，同时抑制机体的免疫功能，在评估肿瘤的复发转移方面有积极的作用[19]。COX-2在NENs中的研究相对较少，检测方法以及样本量都是影响研究的因素，还有更多的功能和调控机制待明确。

大量研究证实，COX-2抑制剂可使肺、乳房、结肠和前列腺等器官癌症风险降低约68%，同时非甾体类抗炎药还可提高肿瘤对放疗以及化疗的敏感性，可能为癌症的预防及治疗提供帮助[20]。国外学者发现，C0X-2抑制剂一方面通过抑制COX-2的表达，从而降低了PGE-2对促凋亡因子PPARγ的抑制作用[21]，另一方面还可通过刺激COX-2表达，诱导促凋亡因子PPARγ的表达[22]。COX-2可作为激素治疗、MicroRNA治疗的靶点以及作为放化疗的辅助用药，为肿瘤的防治提供了新的方向。

综上所述，COX-2的表达与GI-NENs的病理分级、TNM分期相关，病理分级越高，分期越晚，其表达量越高，提示COX-2高表达可能与GI-NENs的发展侵袭有关系。GI-NENs的预后与病理分级、分期、远处转移和COX-2高表达有关系，可预测患者的预后情况。本研究中NET-G3的患者较少，原因可能受既往免疫组化的影响以及本研究样本量的不足。同时随着NENs分级的进一步细化，有必要将病理切片二次评估肿瘤的分级状态。由于NEC、MiNEN的细胞来源以及驱动基因和NETs存在明显差异，COX-2在异质性高的不同病理分级中的作用仍有待深入研究。