定量核磁共振波谱测定黑果枸杞中多糖

张祝莉 郭晔红 姜侃 马锦缘 车晓榕

摘要 目的：建立采用1H核磁共振波谱法定量测定黑果枸杞中多糖的含量。方法：采用核磁共振波谱法，利用Bruker Advance Ⅲ 600核磁共振波谱仪，以重水为溶剂，采用弛豫时间（D1）为1 s，脉冲宽度（P1）14.90 s，样品扫描次数（NS）32次的条件下采集核磁共振氢谱，以化学位移δ为6.40的顺丁烯二酸的氢质子作为内标峰，以葡萄糖化学位移δ为5.22～5.23处双峰信号和δ 4.62～4.64的双峰共同作为定量峰。计算葡萄糖含量。结果：以此方法测定黑果枸杞中多糖的含量在7月份含量最高为0.22 mg/g。结论：栽培黑果枸杞中温差的提高有利于多糖成分的积累。

关键词 黑果枸杞;多糖;核磁共振波谱;定量

Quantitative MRI Spectrum Determination of Polysaccharies in Lycium ruthenicum Murr.

ZHANG Zhuli，GUO Yehong，JIANG Kan，MA Jinyuan，CHE Xiaorong

（College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Institute of Traditional Chinese Medicine，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland and Crop Science，Lanzhou 730070，China）

Abstract Objective：To determine the content of Polysaccharide in Lycium ruthenicum Murr.using 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy quantitively.Methods：MRI spectrometry and Bruker Advanced Ⅲ.600 MRI spectrometer were used，with deuterium oxide used as solvent.With relaxation time（D1）as 1 s，pulse width（P1）as 14.90 s，number of scans（NS）as 32，the nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum was collected.With the hydrogen proton of shunbutene acid with a chemical shift（δ）of 6.40 as the internal standard peak，and the twin peaks at glucose chemical shift（δ）at 5.22～5.23 and 4.62～4.64 as quantitative peaks，glucose content was calculated.Results：The content of polysaccharide in Lycium ruthenicum Murr.was accurate and reliable by this method.Conclusion：The analysis shows that this method can be used for quantitative analysis of polysaccharie in Lycium ruthenicum Murr.，which has the advantages of rapidness，accuracy and convenience.

Keywords Lycium ruthenicum Murr; Polysaccharide; Nuclear magnetic resonance spectroscopy; Quantitative

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.010

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）系茄科（Solanceae）枸杞属（Lycium L.）其果实味甜多汁，富含紫红色素，是中国西北地区一种特有的、亟待开发的野生植物，分布于宁夏、甘肃、青海、新疆等地[1-2]。黑果枸杞具有良好的医疗保健功能，藏医用于心脏病、月经不调、停经等病症[3]。黑果枸杞中特有的多糖成分经药理学研究证明具有降血糖和抗疲劳的活性[4-6]。

目前，关于黑果枸杞多糖的研究比较粗浅，测定方法均采用苯酚—硫酸法、蒽酮—硫酸比色法测定黑果枸杞中多糖含量，但此操作方法在加入硫酸时，结果易受硫酸加入速度影响[6]。黑果枸杞随着采收期的不同其含量也存在差异，探究甘肃武威的黑果枸杞不同采收期多糖的含量差异，可为黑果枸杞质量评价提供依据。不同产地的黑果枸杞中其多糖含量存在差异，通过对不同产地的黑果枸杞多糖含量差异，可挑选出优质产地资源，为黑果枸杞栽培奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

核磁共振波谱仪（布鲁克公司，德国，型号：Bruker Advance Ⅲ 600）;万分之一天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：AL104型）;超纯水器-优普系列（西安优普仪器设备有限公司，型号：UPT-I-5/10/20T）;恒温水浴锅（泰斯特公司，型号：DK-98）。

1.2 试剂

D2O（安耐吉化学有限公司，批号：MFCD00044636）;无水葡萄糖标准品（北京索莱宝有限公司，批号：1122A0214，纯度≥98%）;顺丁烯二酸（麦克林试剂公司，批號：MFCD00005518）;石油醚（30～60 ℃分析纯，天津大茂试剂公司，批号：20171632）。

1.3 分析样品

分别于2019年6月28日、7月28日、8月28日采摘甘肃武威（平均日最高温度6月28.86 ℃，7月29.41 ℃，8月25.20 ℃;平均日最低温度6月15.8 ℃，7月16.80 ℃，8月12.20 ℃）;甘肃张掖;甘肃民勤;新疆和田;青海海西州的鲜果，采后的鲜果经55 ℃烘干后粉碎过40目筛备用（经甘肃农业大学郭晔红副教授鉴定为茄科黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.果实）。

2 方法与结果

2.1 核磁共振定量条件

采用zg 30脉冲序列，谱宽（SWH）为11 904.8 Hz，弛豫时间（D1）为1 s，脉冲宽度（P1）14.90 s，样品扫描次数（NS）32次。测定样品的NMR谱图。积峰时先选择重水残留的水峰进行矫正，校正谱图后选定峰积分区间，每个峰积分5次，相对标准偏差（RSD）<1%时取平均值，用《中华人民共和国药典2015版》中的绝对定量公式计算待测组分的重量。所有数据均使用MestReNova软件处理核磁共振波谱、采用SPSS 19.0统计软件进行分析。Ws=Wr×（As/Ar）×（Es/Er）。其中Wr为内标物的重量，As和Ar分别为供试品特征峰和内标峰的峰面积，Es和Er分别为供试品和内标物的质子当量重量（质量）（以分子量除以特征峰的质子数计算得到），然后根据称样量计算组分在样品中的含量。

2.2 氘代溶剂的选择及葡萄糖1H-NMR谱图的归属

合适的氘代溶剂对样品溶解性能好，且谱峰不与待测峰发生重叠。氘代甲醇易挥发，样品在氘代甲醇中溶解度差。样品及马来酸在重水中均有较好的溶解度，且谱峰不与样品峰重叠，因而选用重水作为溶剂。重水空白实验的1H-qNMR谱图，溶剂峰归属为：δ 4.79（s，H2O）。δ 5.220归属为α-D-吡喃葡萄糖的端基质子1-H，受2-H的耦合而裂分为双峰，耦合常数3JH-H=3.7 Hz。δ：4.630归属为β-D-吡喃葡萄糖的端基质子1-H，受2-H的耦合而裂分为双峰，耦合常数3JH-H=8.0 Hz[8]。无水葡萄糖结构见图1。

2.3 内标和定量峰的选择

本实验选用重水作为溶剂，顺丁烯二酸作为内标，顺丁烯二酸具有易于识别的尖锐单峰，且不与样品的定量峰发生重叠。顺丁烯二酸与黑果枸杞样品1H-qNMR谱见图2。由图谱可知，顺丁烯二酸溶剂峰归属为δ 6.40（s，D2O），不干扰葡萄糖的谱峰，专属性较高。因此，选择顺丁烯二酸作为内标。由于葡萄糖δ 5.22-5.23（d，D2O）处是一独立双峰，完全与其他信号分离，且与内标物的定量峰化学环境相近。因此，选择葡萄糖δ 5.22-5.23处双峰信号作为定量峰和δ 4.62-4.64的双峰共同作为定量峰。

2.4 对照品溶液的制备

准确称取50.00 mg无水葡萄糖对照品溶解至5 mL容量瓶内，重水定容至刻度，制得11.00 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液。

2.5 供试品溶液的制备

准确称取黑果枸杞粉末12.000 0 g，加入180 mL石油醚，置于索氏提取器中，索氏提取2.5 h，至提取溶液无色，取出，挥干溶剂备用，得挥去石油醚得到黑果枸杞脱脂粉末。准确称取脱脂后粉末1.000 0 g，加入25 mL超纯水至于50 mL三角瓶内，置于90 ℃恒温水浴锅内提取1.5 h，提取2次，合并滤液，于90 ℃水浴上挥干、得粗浸膏并称重。

取黑果枸杞多糖浸膏20 mg，精密称定，加内标溶液顺丁烯二酸50 μL（顺丁烯二酸122 mg，溶于1.22 mL重水），再加入550 μL重水，全部溶解后，用移液枪全部移至核磁管内，用于氢谱核磁共振波普测定。

2.6 內标溶液的制备

准确称取12.2 mg内标物顺丁烯二酸溶解至1.22 mL重水中，制得10.00 mg/mL内标溶液，以作为用于1H-qNMR样品定量的内标样品;准确称取20 mg内标物顺丁烯二酸溶解至2 mL重水中，制得10.00 mg/mL内标溶液，以作为用于线性关系考察时1H-qNMR定量的内标储备液。

2.7 线性关系考察

精密称取无水葡萄糖标准品10 mg加入2 mL重水溶解成为标准品储备液，混匀后分别吸取标准品储备液50、100、200、300、400、500 μL，加入50 μL内标溶液储备液后加入重水补足600 μL。混匀，配制后全部移制核磁管中，按“2.1”进行测定。以（样品/内标）质量比为横坐标（X），1H-qMNR定量峰面积比为纵坐标（Y），用纯品对照品评价的零截距标准曲线为：Y=0.147X-0.087 4，相关系数R2=0.999，同时核磁管中所含葡萄糖的浓度作为横坐标（X），1H-qMNR定量峰面积比为纵坐标（Y），制做浓度与面积的标准曲线为Y=0.883X-0.088 7，相关系数R2=0.999。

2.8 仪器精密度试验

称取新疆样品制备的浸膏和内标，用供试品溶液制备方法制备，测试6次，结果葡萄糖峰面积/内标峰面积RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.9 样品稳定性试验

黑果枸杞新疆样品的供试品的核磁管，分别在1、2、4、6、8、10、24 h在“2.1”核磁条件下测定样品稳定性，稳定性RSD为2.5%（n=7），说明本实验样品在室温24 h下具有良好的稳定性。

2.10 重复性试验

取黑果枸杞新疆样品，按照“2.5”制备平行制备供试品5溶液，分别置于按照“2.1”核磁条件下测试样品重复性，获取1H-NMR谱并积分计算定量峰与内标峰的峰面积比值重复性RSD为1.5%。

2.11 回收率试验

取新疆样品提取后浸膏10.0 mg，在“2.1”核磁共振波谱测定条件测定样品1H-qNMR法测定其中所含葡萄糖的含量;加入适量的D-无水葡萄糖标准品共同溶解后，按照“2.1”测定含量，计算加样回收率。结果葡萄糖回收率为98.6%～100.3%，RSD=0.9%（n=5）。

2.12 样品含量的测定

取黑果枸杞不同采收时期样品，按照“2.5”方法制备供试品溶液，按照“2.1”核磁条件进行测试，分析样品图谱积峰面积，计算样品含量。见表1。多糖含量逐渐增加。通过不同采收期的多糖含量与环境温度的相关性分析，结果见表2得出黑果枸杞中多糖含量与平均日温差有极显著性相关性，适当提高温差可提高黑果枸杞中多糖含量，在人工栽培中可适当增加温差来增加黑果枸杞中多糖的含量。

取不同产地的黑果枸杞样品，按“2.5”项提取方法提取黑果枸杞中多糖的含量，按“2.1”方法测定不同产地的黑果枸杞中多糖的含量。结果测得青海海西州黑果枸杞中多糖含量为0.29 mg/g，新疆和田为0.27 mg/g，甘肃武威为0.23 mg/g，甘肃张掖为0.22 mg/g，甘肃民勤为0.17 mg/g。

3 讨论

3.1 核磁条件的确定

弛豫时间（D1）和扫描次数（NS）的选择：弛豫时间（D1）和扫描次数（NS）是qNMR测试中非常重要的参数。本研究考察了标准品D1分别在1、2、3、5、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60 s时NS分别在16、32、64、128时，对D-δ无水葡萄糖含量的影响。结果表明，当D1=1 s时、NS≥32时比值趋于稳定（AS是样品所含葡萄糖定量峰的积分面积，Ar是内标物质顺丁烯二酸定量峰的积分面积），因此选择1 s作为弛豫时间，选择32作为扫描次数。

3.2 氘代溶剂的选择

黑果枸杞浸膏能够同时溶解于氘代甲醇和重水中，不溶于氘代二甲基亚砜[9]，经试验表明黑果枸杞样品在氘代甲醇中残留水峰δ 4.87与多糖的定量峰δ 5.07～5.82（d，CD3OD）分离度较差。样品在重水中溶解度较好且样品定量峰不与残留的重水质子信号δ 4.79分离度较好，故此选用重水作为氘代溶剂[10-13]，内标物质经过试验邻苯二氢钾、吡嗪、对苯二酚、顺丁烯二酸等内标物质，结果表明顺丁烯二酸和样品在重水中分离情况良好，不与样品峰重合。内标溶液浓度的由同一样品的比较不同梯度25、50、100、150 μL内标液进行比较，结果表明内标液50 μL可与样品定量峰既不太高，又不低于定量峰[14-16]。

3.3 结论

定量核磁测定黑果枸杞中多糖的含量，可以快速准确的对黑果枸杞中多糖进行定量分析，核磁共振波谱定量测定黑果枸杞多糖的方法具有时间短，线性关系良好，稳定性和重复性较好的优点，通过试验结果表明核磁共振波谱法测定多糖对照品的含量准确，该方法具有快速、简便、不破坏样品的特点。通过定量核磁共振波谱技术对黑果枸杞中多糖的分析表明，在不同采收期时8月份黑果枸杞中多糖含量最高达0.31 mg/g，青海海西州黑果枸杞多糖含量最高达0.29 mg/g。

甘肃武威的黑果枸杞在8月份采收时做含量最高为0.31 mg/g，不同产地為青海海西州的黑果枸杞多糖含量最高。以枸杞子2015版药典标准为参考，表明青海海西州黑果枸杞质量最佳。黑果枸杞总多糖的测定是必不可少的一部分，通过定量核磁测定黑果枸杞中多糖的含量，可以快速准确的对黑果枸杞中多糖进行定量分析。核磁共振波谱定量测定黑果枸杞多糖的方法具有时间短[13-19]，试验结果表明核磁共振波谱法测定多糖对照品的含量，线性关系、精密度、稳定性和重复性良好，具有快速、简便、不破坏样品的特点，该方法可有效避免苯酚-硫酸法测定多糖时因硫酸加入的速度对其含量测定的影响。

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（2020-04-14收稿 本文编辑：杨觉雄）