艾灸治疗慢性萎缩性胃炎的临床观察及对其外周血DNA甲基化的影响

顾沐恩 黄艳 刘雅楠 刘慧荣 黄儒德 吴璐一 彭广彬 李国娜 李璟 吴焕淦

摘要 目的：觀察隔药饼灸及隔姜灸治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的临床疗效，探讨艾灸对CAG相关癌前病变外周血DNA甲基化谱的影响。方法：选取2018年5月至2020年10月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科收治的CAG患者70例作为研究对象，随机分为隔药饼灸组和隔姜灸组，每组35例，2组患者均选取中脘、气海、双侧足三里、双侧内关穴进行治疗。比较2组治疗前后中医症状评分、光镜下胃黏膜组织病理学变化，评价2组的临床疗效，并选取每组治疗前后患者全血样本各2例，采用全基因组甲基化测序，结合生物信息学分析，观察外周血DNA甲基化位点和甲基化状态的变化。结果：1）治疗后，2组中医症状总积分均较治疗前显著降低（均P<0.01），隔药饼灸组胃脘疼痛、食欲减退症状积分低于隔姜灸组（均P<0.01），隔姜灸组烧心、反胃症状积分低于隔药饼灸组（均P<0.01）;隔药饼灸组临床总有效率为87.88%，隔姜灸组为78.79%，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后2组胃黏膜的萎缩、肠化病变程度及隔药饼灸组的炎症程度有明显改善（P<0.05）。隔药饼灸组胃镜病理总体有效率82.14%，隔姜灸组总体有效率69.57%，差异无统计学意义（P>0.05）。2）CG序列环境下，治疗前后隔药饼灸组共有176个差异甲基化基因，隔姜灸组有652个差异甲基化基因。隔药饼灸组治疗前后差异甲基化区域（DMR）锚定启动子区域相关基因涉及的KEGG通路包括cAMP、AMPK和核因子κB信号通路、泛素介导的蛋白水解等，隔姜灸组涉及的KEGG通路包括mTOR和HIF-1信号通路、代谢通路、细胞凋亡等。结论：隔药饼灸和隔姜灸可改善慢性萎缩性胃炎患者临床症状，减轻胃黏膜萎缩、肠化生等病理状态;隔药饼灸在改善患者胃脘疼痛、食欲减退症状更具优势，而隔姜灸在改善患者烧心、反胃症状更优。艾灸能影响CAG患者外周血全基因组DMR的DNA甲基化水平，这可能是艾灸对CAG的表观遗传调控机制之一。

关键词 艾灸;慢性萎缩性胃炎;DNA甲基化

Clinical Observation of Moxibustion on Patients with Chronic Atrophic Gastritis and Its Effect on DNA Methylation in Peripheral Blood

GU Muen1，HUANG Yan2，LIU Yanan2，LIU Huirong1，2，HUANG Rude2，WU Luyi1，2，PENG Guangbin1，LI Guona3，LI Jing1，WU Huangan1，2

（1 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To observe the clinical efficacy of herb-partitioned moxibustion （HM） and ginger-partitioned moxibustion （GM） in the treatment of chronic atrophic gastritis （CAG） and explore the effect of moxibustion on DNA methylation in peripheral blood of CAG-related precancerous lesions.Methods：Seventy CAG patients who were treated in the Acupuncture and Moxibustion Department of Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine from May 2018 to October 2020 were randomly divided into an HM group and a GM group，with 35 cases in each group.“Zhongwan” （CV 12），“Qihai” （CV 6），bilateral “Zusanli” （ST 36），and bilateral “Neiguan” （PC 6） were selected for treatment in both groups.The clinical efficacies were evaluated by comparing the symptom scores of traditional Chinese medicine （TCM） and the gastric mucosal changes under gastroscopy before and after treatment.Whole blood samples from two patients in each group were collected before and after treatment.Genome-wide methylation sequencing and bioinformatics analysis were used to observe the changes of DNA methylation sites and methylation status in the peripheral blood.Results：1） The post-treatment TCM symptom scores were lower than pre-treatment ones in both groups （both P<0.01）.The scores of gastric pain and loss of appetite were lower in the HM group and heartburn and nausea scores were lower in the GM group after treatment （both P<0.01）.The total clinical effective rates were 87.88% and 78.79% in the HM group and the GM group，respectively （P>0.05）.The histopathological changes in the gastric mucosa atrophy and intestinal metaplasia of the two groups as well as the degree of mucosal inflammation in the HM group were improved after treatment （P<0.05）.The total effective rates of gastroscopy were 82.14% and 69.57% in the HM group and the GM group （P>0.05）.2） In the CG sequencing environment，there were 176 and 652 differentially methylated genes in the HM group and the GM group，respectively，before and after treatment.In the HM group，the KEGG pathways of genes involved in the differentially methylated region （DMR）-anchored promoter region before and after treatment included cAMP，AMPK，and NF-κB signaling pathways，ubiquitin-mediated proteolysis，etc.，while in the GM group，the KEGG pathways included mTOR and HIF-1 signaling pathways，metabolic pathway，cell apoptosis，etc.Conclusion：Both HM and GM can improve the clinical symptoms of CAG patients and alleviate pathological conditions such as gastric mucosal atrophy and intestinal metaplasia.HM is advantageous in improving the symptoms of gastric pain and loss of appetite，while GM is potent in improving the symptoms of heartburn and nausea.Moxibustion can affect the DNA methylation levels in the DMR of the whole genome in the peripheral blood of CAG patients，which may be one of the epigenetic regulatory mechanisms of moxibustion against CAG.

Keywords Moxibustion; Chronic atrophic gastritis; DNA methylation

中图分类号：R246.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.002

慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是一种以胃黏膜固有腺体形态萎缩、数量减少，胃黏膜变薄，黏膜肌层增厚为特征的慢性消化系统疾病。研究证实CAG特别是伴有不完全型肠上皮化生（Intestinal Metaplasia，IM）和（或）中重度异型增生（Dysplasia，Dys）者有癌变倾向。据最新流行病学统计显示，2020年全球新发胃癌病例约108万，死亡约76.9万。发生率与死亡率分别为全球癌症第6位与第4位[1-2]。因其临床表现无特异性，疾病早期易被忽略，患者生存率偏低[3]。因此，开展胃癌癌前病变的防治具有重要的临床意义。

CAG可归属于中医“胃脘痛”“痞满”“嘈杂”等。针灸治疗CAG有其独特优势，在改善患者临床症状、调节机体免疫、保护及修复胃黏膜等方面都表现出较好的治疗效果[4-7]，但艾灸治疗CAG的效应机制还有待进一步明确。DNA甲基化是表观遗传修饰形式之一，与慢性炎症介导的癌变密切相关。有研究表明，胃炎患者DNA甲基化水平与胃黏膜炎症活动有关，在CAG伴肠化生等胃癌前病变中发现与肿瘤相关基因的启动子区域高甲基化;并且在癌变过程中，CpG岛区域的DNA甲基化水平呈现逐渐升高的趋势，使特定区域的肿瘤抑制基因缺失或失活，促进了胃癌的发生发展[8]。因此，本研究拟进一步证实隔药饼灸及隔姜灸对CAG的临床疗效，研究艾灸对CAG患者外周血DNA甲基化谱的影响，以期为针灸在CAG的临床应用提供客观的科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年5月至2020年10月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科收治的CAG患者70例作为研究对象，采用SPSS 21.0统计软件生成随机数字，根据患者的就诊顺序，按照1∶1比例将患者随机分为隔药饼灸组和隔姜灸组，每组35例。试验过程中隔药灸组脱落2例，隔姜灸组脱落2例，最终每组完成33例，共完成66例。其中隔药饼灸组中男14例，女19例，年龄37～74岁，平均年龄为61.55岁，病程6个月至50年，平均病程为8.68年，隔姜灸组中男12例，女21例，年龄33～74岁，平均年龄为59.36岁，病程2个月至30年，平均病程为8.67年。2组患者性别、年龄、病程等一般资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院伦理委员会的伦理审查（伦理审批号：2017-013）。

1.2 诊断标准 参照《中国慢性胃炎共识意见（2017年，上海）》[9]以及《慢性萎縮性胃炎中西医结合诊疗共识意见（2017年）》[10]中的诊断标准。具体如下：1）胃镜诊断标准：黏膜红白相间、以白为主，黏膜皱襞变平甚至消失，部分黏膜血管显露，可伴有黏膜颗粒或结节状等表现。2）病理诊断标准：只要慢性胃炎病理活检显示有固有腺体萎缩，即可诊断为萎缩性胃炎，而不必考虑活检标本的萎缩块数和程度。

1.3 纳入标准 1）符合CAG的诊断标准;2）年龄18～75岁，性别不限;3）自愿加入本研究并签署了知情同意书。

1.4 排除标准 1）合并严重肝、肾、心脑血管、血液系统、内分泌疾病者以及精神病患者;2）妊娠或准备妊娠妇女，哺乳期妇女;3）伴有结核、肝炎、艾滋、淋病等传染病患者;4）有明显出血倾向，和（或）严重糖尿病患者。

1.5 脱落与剔除标准 1）受试者依从性差，未配合完成治疗者;2）试验过程中接受其他治疗或有明显的其他干预因素而影响疗效判定者;3）病情恶化或出现其他严重疾病而无法继续治疗者;4）出现严重不良反应或不良事件者;5）在治疗期间自行退出研究或失访者。

1.6 治疗方法 2组患者均取穴中脘、气海、足三里（双）、内关（双）穴。隔药饼灸组将含有制附子、肉桂等的中药碾粉，加黄酒调成厚糊状，每个药饼含药粉2.5 g，黄酒3 g，用模具按压成直径2.3 cm、厚度0.5 cm大小;隔姜灸组将新鲜生姜切成直径2.3 cm、厚度0.5 cm大小姜片，用直径1 mm粗针扎20个孔。分别将药饼或姜片置于艾灸托具下层，铁丝网上置长约17 mm、直径2 cm、重约1.8 g的艾炷，点燃后置于穴位上进行隔药饼灸或隔姜灸，每穴各灸1壮/次，3次/周，共治疗24周。治疗采用单盲法，患者全程不知晓自己所在的治疗组别，并设立操作人员以外的独立人员分别进行疗效评价、数据采集和统计分析。

1.7 观察指标

1.7.1 胃肠中医症状积分 参照《胃肠疾病中医症状评分表》[11]对患者进行中医症状评分，所有症状均分为无、轻、中、重4级赋予积分值，于治疗前后填写量表进行评估。

1.7.2 胃黏膜组织病理学观察 于光学显微镜下观察胃黏膜的组织病理学形态，参考《中国慢性胃炎共识意见（2017年，上海）》[9]将胃黏膜组织病变分炎症、活动性、萎缩、肠化、异型增生，根据程度分为无、轻、中、重四级（-、+、++、+++），观察患者治疗前后胃黏膜组织病理学变化。

1.7.3 DNA甲基化测序及分析 根据患者临床症状及胃镜组织病理学改善情况，每组选取疗效较优的2例患者，于治疗前及治疗结束后，使用EDTA抗凝采血管采集患者空腹外周静脉血3～5 mL。1）DNA提取与处理后进行文库构建与质控：提取DNA，超声破碎至200～400 bp大小片段;进行末端修复加A尾，连接对应的测序接头;对加了测序接头的DNA重亚硫酸盐（Bisulfite）处理，未发生DNA甲基化的C变成U（在PCR扩增以后改变为T），而发生DNA甲基化的C保持不变，再PCR扩增，构建好WGBS文库后，定量加入稀释液后使用Agilent 2100检测片段长度上机测序;2）测序数据质控和参考序列比对：应用Illumina测序使用cutadapt过滤掉不合格的序列后得到有效数据（Clean Data），质控后采用BSMAP软件进行比对分析;3）甲基化位点检测：比对完成后采用Bsmap软件检测发生甲基化的位点;4）使用Metilene软件分析差异甲基化区域（Different Methylation Region，DMR），统计DMR数量分布;5）组间DMR锚定启动子区域差异基因筛选：筛选标准为差异甲基化区域位于启动子区，diff绝对值大于0.1，且P<0.05;6）对基因启动子区域（转录起始位点上游1.5K到转录起始位点下游0.5K）有交叠的基因进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。

1.8 疗效判定标准

胃肠中医症状积分疗效参照《慢性胃炎中西医结合诊疗共识意见（2011年天津）》[12]中的标准：1）临床痊愈：主要症状、体征消失或基本消失，疗效指数≥95%;2）临床显效：主要症状、体征明显改善，70%≤疗效指数<95%;3）临床有效：主要症状、体征明显好转，30%≤疗效指数<70%;4）临床无效：主要癥状、体征无明显改善，甚或加重，疗效指数<30%。疗效指数=[（治疗前积分-治疗后积分）/治疗前积分]×100%。

胃镜下胃黏膜病理疗效参考《慢性胃炎中西医结合诊疗共识意见（2011年天津）》[12]中胃镜及病理学疗效判定标准：1）治愈：胃镜复查活动性炎症消失，慢性炎症好转达轻度;腺体萎缩、肠化生和异型增生消失;2）显效：黏膜急性炎症基本消失，慢性炎症好转;腺体萎缩、肠化生和异型增生明显减轻;3）有效：黏膜病变范围缩小1/2以上，炎症有所减轻;腺体萎缩、肠化生和异型增生减轻;4）无效：内镜及病理学所见均无好转者。

1.9 统计学方法 本研究临床数据采用符合方案集（Per Protocol Set，PPS）进行分析。采用SPSS 21.0软件进行数据统计，计数资料采用例或构成比表示，组间比较采用χ2检验（Chi-Square Test）。计量资料若符合正态分布且方差齐性，用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验;若数据不符合正态分布，采用M（P25，P75）表示，2组间比较采用Mann-Whitney U法，组内比较采用Wilcoxon（W）法。2组疗效比较采用Ridit分析，有效率比较采用χ2检验。取检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组CAG患者中医症状积分比较

治疗后，2组患者中医症状总积分均显著降低（均P<0.01），而2组间治疗前后差值比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。治疗后，2组患者的胃脘痞满、食后腹胀、泛酸、嗳气、口苦、便秘、精神疲乏、畏寒怕冷、烦躁易急、失眠多梦等单个主要症状积分均明显降低（P<0.05或P<0.01），2组患者上述症状的积分差值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后隔药饼灸组胃脘疼痛、食欲减退症状积分明显降低（P<0.01），且症状积分的差值优于隔姜灸组（P<0.01），而治疗后隔姜灸组烧心、反胃症状积分明显降低（P<0.01），此症状积分的差值优于隔药饼灸组（P<0.05）。见表2。

2.2 2组CAG患者中医症状疗效

比较根据2组患者治疗后中医症状积分改善情况，隔药饼灸组显效2例，有效27例，无效4例;隔姜灸组显效0例，有效26例，无效7例。隔药饼灸组疗效优于隔姜灸组，但差异无统计学意义（P>0.05）。隔药饼灸组总有效率87.88%，隔姜灸组总有效率78.79%，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.3 2组CAG患者胃黏膜病理学比较

66例患者中，共有51例患者在治疗后进行了胃镜和病理学复查，其中隔药饼灸组28例，隔姜灸组23例。与治疗前比，2组治疗后胃黏膜的萎缩、肠化病变程度有明显改善，隔药饼灸组治疗后胃黏膜的炎症也明显改善（P<0.05），2组患者治疗后胃黏膜的各项病变程度差异无统计学意义（P>0.05）。见表4～5。

2.4 2组CAG患者胃黏膜胃镜病理学疗效比较

隔药饼灸组28例患者治疗后进行了胃镜复查，其中显效13例，有效10例，无效5例;隔姜灸组23例患者治疗后进行了胃镜复查，其中显效7例，有效9例，无效7例。根据Ridit分析结果，隔药饼灸组胃镜病理学疗效优于隔姜灸组，但差异无统计学意义（P>0.05）。Pearson卡方检验结果，隔药饼灸组总有效率82.14%，隔姜灸组总有效率69.57%，差异无统计学意义（P>0.05）。见表6。

2.5 DNA甲基化测序分析

经DNA样本检测和文库质检，8个样本文库均合格，可用于全基因组甲基化测序分析。

2.5.1 全基因组平均甲基化水平 对所有样本在全基因组范围和CG、CHG、CHH不同序列环境下的C位点甲基化水平进行统计，隔药饼灸组治疗前全基因组平均甲基化水平为0.047 25，隔药饼灸组治疗后全基因组平均甲基化水平为0.046 15，隔姜灸组治疗前全基因组平均甲基化水平为0.040 14，隔姜灸组治疗后全基因组平均甲基化水平为0.039 96。在CG序列环境下，隔药饼灸组和隔姜灸组样本甲基化水平均高于CHG与CHH序列，2种灸法治疗组间全基因组平均甲基化水平类似。见表7和图1。

2.5.2 差异甲基化区域（DMR）检测 差异甲基化区域是指不同样本或者组别间的甲基化水平有明显区别，由基因组上连续甲基化位点构成的一个区域，可调控基因表达，进而影响基因功能。应用Metilene软件分析具体的DMR，结果发现不同组间比较的DMRs绝大多数都位于CG序列环境，CHH次之，而在CHG序列下的DMRs最少。因此，下面仅展示在CG序列环境下2组治疗前后比较的DMR个数。如表8所示，CG序列环境下，隔药饼灸组治疗前后比较共有1 384个DMRs，其中高甲基化状态的DMR数有758个，低甲基化水平的有626个;隔姜灸组治疗前后比较共有6 327个DMRs，其中高甲基化状态的DMR数有3 195个，低甲基化水平的有3 132个。

2.5.3 DMR锚定启动子区域差异甲基化基因的筛选 基于DMR在基因组上的分布，筛选出CG序列环境下，隔药饼灸组治疗前后、隔姜灸组治疗前后的基因启动子区域差异甲基化基因。CG序列环境下，隔药饼灸组治疗前后共有176个差异甲基化基因，隔姜灸组治疗前后共有652个差异甲基化基因。通过文献检索，结合这些差异基因涉及的信号通路，列出与炎症、胃炎、胃癌前病变或胃癌等相关的差异甲基化基因。见表9～10。

2.5.4 DMR锚定启动子区域相关基因KEGG富集分析 基于DMR在基因组上的分布，对和基因启动子区域有交叠的基因进行KEGG通路富集分析。对富集最显著的20条通路进行展示。见图2。CG序列环境下：2组治疗前后DMR锚定启动子区域相关基因涉及的KEGG通路均包括内质网中的蛋白质加工。另外，隔药饼灸组涉及的KEGG通路还包括cAMP、AMPK、核因子κB信号通路、泛素介导的蛋白水解等;隔姜灸组涉及的KEGG通路还包括mTOR、HIF-1信号通路、代谢通路、细胞凋亡等。2组治疗前的DMR锚定启动子区域相关基因涉及的KEGG通路包括AMPK、HIF-1、cAMP信号通路等。2组治疗后的DMR锚定启动子区域相关基因涉及的KEGG通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞跨内皮迁移、癌症的途径、RIG-I-样受体信号通路、泛素介导的蛋白水解等。

3 讨论

CAG的发病机制尚未阐明，西医治疗CAG只能针对患者症状给予对症处理，如抗幽门螺杆菌感染药物、胃黏膜保护制剂、促胃动力药物等，虽短期内有一定疗效，但长期服用会造成药物耐受和不良反应，效果并不理想。中医认为，脾胃乃人体后天之本，气血生化之源，“内伤脾胃，百病由生”“有胃气则生，无胃气则死”[13]。本病的发生以本虚（脾胃虚弱）为主，加之外感寒邪、饮食不节（洁）、情志不舒，使气机不畅、胃失和降，从而引起胃脘疼痛、腹胀痞闷、恶心呕吐、嗳气泛酸等不适。隔物灸，是将艾炷与皮肤之间衬隔药物或材料进行施灸的一种方法[14]。现代研究表明，隔物灸主要通过在体表穴位运用艾灸的热力及药物的透皮作用，综合其温热效应、辐射效应、药化效应等，发挥灸、药、穴3者的联合效用[15]，芳香性药物如附子、生姜等，可使药物的透皮吸收能力极大提高[16]。另外，通过实验比较发现[17]，隔附子饼灸、隔姜灸等在燃烧过程中所产生的光谱与人体穴位红外辐射光谱高度一致，因穴位辐射共振原理而形成最佳吸收，其效用优于传统艾条灸。足三里乃胃之下合穴，《灵枢·邪气藏府病形》有云“合治內府”，说明下合穴是治疗六腑病的主要穴位;而胃之募穴中脘，因其位置与胃脘部相近，因而在治疗胃腑病上有其特殊疗效。足三里与中脘“合募相配”，此乃取合穴和募穴在治疗上的共同特性，通过相互协作以增强通调腑气、和胃止痛的疗效。而足三里与内关的“上下配穴”，体现了中医治病的整体观念，在足三里通调胃气之际，内关可宁神和胃，共治呕吐呃逆、不思饮食等证。气海乃元气之海，藏精之府，足三里乃胃气之本，水谷精微之源，两穴相配，可助胃熟谷，升阳健运。

本研究结果显示，经过6个月治疗，隔药饼灸组及隔姜灸组患者的中医症状积分均显著降低，其中隔药饼灸组总有效率87.88%，隔姜灸组总有效率78.79%，2组患者治疗后胃脘痞满、食后腹胀、泛酸、嗳气、口苦、便秘、精神疲乏、畏寒怕冷、烦躁易急、失眠多梦等症状改善明显，提示隔药饼灸、隔姜灸治疗均能有效改善患者上述临床症状。同时，隔药饼灸在改善患者胃脘疼痛、食欲减退症状更具优势，而隔姜灸在改善患者烧心、反胃症状更优。隔药

饼灸的药饼以制附子、肉桂等中药配比而成，共奏温阳健脾、理气和中之效以治其本，清热燥湿、活血化瘀以治其标，针对患者胃脘疼痛、食欲减退等症状，充分发挥了其和胃止痛、健脾助运之功。隔姜灸取生姜“呕家圣药”之特性，针对患者反胃、烧心等症状，体现了其温中止呕、和胃降逆之良效。本研究中，综合评估胃黏膜组织病理学的炎症、活动性、萎缩、肠化生、异型增生等5项病变程度，结果显示隔药饼灸组患者治疗后胃黏膜的炎症、萎缩、肠化病变程度明显改善，而隔姜灸组患者治疗后胃黏膜的萎缩、肠化病变程度也有明显改善，对于积分无明显变化的活动性及异型增生2项病变进行分析发现，隔药饼灸组活动性呈阳性的8例患者在治疗后均较前好转，隔姜灸组9例阳性患者好转，2例无改变;异型增生在2组各有2例病例呈阳性，治疗后隔药饼灸组2例均转阴，隔姜灸组2例无变化。由此可见，虽然这2项病变的分值改变差异无统计学意义，但艾灸对胃黏膜炎症活动性及异型增生仍有改善趋势，其疗效有待今后扩大样本量进一步验证。综合胃镜及胃黏膜组织病理学结果显示，隔药饼灸组总体有效率82.14%，隔姜灸组总体有效率69.57%，2组间比较差异无统计学意义。提示隔药饼灸、隔姜灸治疗均能改善CAG患者胃黏膜组织病理学变化，减轻CAG患者胃黏膜萎缩、肠化病变程度。

DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰形式之一，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基基团添加到胞嘧啶的5′位置上，从而产生5-甲基胞嘧啶[18]。其中CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点，此区域称为CpG岛[19]，DNA甲基化的异常在CAG及其相关性癌变的发展中有重要作用，在慢性胃炎患者中，胃黏膜的炎症反应使大量CpGs发生超甲基化和低甲基化[20]。本研究结果显示，8个外周血样本中C位点甲基化主要发生在CG序列环境下，CG序列环境下的全基因组平均甲基化水平均高于CHG与CHH序列。通过对组间全基因组平均甲基化水平比较发现，2组治疗前后的全基因组平均甲基化水平无明显差异，且组内每组治疗前后的甲基化水平基本类似。这可能是由于人的个体差异较大，不同CAG患者的全基因组甲基化水平本身也存在较大差异，此外，全基因组甲基化水平反映的是所有差异基因的整体水平，关键还是要聚焦具体基因的甲基化水平是增高或降低。本研究中，组间比较的DMRs基本都位于CG序列环境。隔药饼灸组治疗前后DMR锚定启动子区域相关基因涉及cAMP、AMP活化蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）和核因子κB信号通路等炎症相关通路;隔姜灸组涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）和缺氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1）信号通路、代谢通路、产生IgA的肠道免疫网络、细胞凋亡等与自噬、免疫炎症、代谢相关的通路。以往研究发现萎缩性胃炎大鼠胃黏膜核因子κB/HIF-1α通路异常激活[21]，CAG患者不同胃黏膜萎缩病变程度也与p-NF-κB p65表达正相关，针刺可能通过调节核因子κB信号转导系统起到减轻CAG炎症反应，减轻胃黏膜细胞的凋亡，从而达到保护胃黏膜的作用[22-23];mTOR通路异常激活、胃黏膜上皮细胞凋亡增加在CAG胃癌前病变的发生发展中也起到了重要作用[24-26]。

综上所述，艾灸可能通过调节差异甲基化基因的甲基化水平，经转录后调控参与调节这些基因涉及的信号通路，从而起到治疗CAG的作用。甲基化调控是一个复杂的过程，本研究只初步观察了艾灸对CAG患者外周血DNA甲基化谱的影响，只是对DMR锚定启动子区域相关基因进行了KEGG富集分析，还不能充分说明差异基因的甲基化水平是否发生变化，今后可运用高通量BSP甲基化测序进行验证，并结合细胞实验等深入探讨这些基因对CAG的影响，为艾灸治疗CAG的临床应用提供科学依据。

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（2022-01-06收稿 本文编辑：吴珊）