NOTCH2基因甲基化与幼年特发性关节炎的关系及其机制*

王 军，张育民，马 涛，宋 伟

（西安市红会医院关节外科，西安 710054）

幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是小儿时期常见的结缔组织病，以慢性关节滑膜炎为主要特征，常伴随有全身多脏器功能损坏，临床症状主要表现为疼痛、肿胀及活动受限，是导致小儿残疾和失明的主要疾病之一。JIA是一种慢性疾病，目前尚无治愈的可能，其治疗目标在于最大程度缓解患儿临床症状，预防及减少器官损伤，进而改善患儿生活质量[1]。DNA甲基化在转录调控中起重要作用[2]。有研究发现患有各种自身免疫性疾病[包括类风湿性关节炎（RA），系统性红斑狼疮，炎症性肠病和1型糖尿病]的个体中存在DNA甲基化现象。Morgan 首次描述了NOTCH基因，发现哺乳动物中有4个NOTCH受体（NOTCH1～NOTCH4）和5个NOTCH配体[3]。NOTCH受体与相邻细胞之间的配体可相互作用并激活决定各种器官中细胞命运的途径[4-5]。此外，在胚胎和成年组织中，NOTCH 信号在细胞分化，增殖和凋亡中发挥重要作用[3]。有学者发现在成人RA进展中NOTCH信号参与滑膜炎的发生，且在RA 成纤维滑膜细胞中NOTCH 高表达，且可以参与肿瘤坏死因子α（TNFα）介导的滑膜细胞炎性增殖。还有研究发现，促炎性细胞因子白介素（IL）-8 是由TNF-α 诱导产生的，且TNF-α 与JIA 发病机制有关[6]。但目前有关NOTCH2基因甲基化与JIA的关系及可能机制的研究报道较少。因此，本研究拟探讨TNF-α治疗前后NOTCH 信号传导对JIA 患者的影响，以期为JIA 的靶向治疗提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 样本采集及细胞培养 收集2018 年1 月至2019 年1 月在西安市红会医院关节外科收治的JIA患儿，从使用抗TNF 治疗前（T0）和治疗后（用药治疗6 周后，Tend）抽取有关JIA 患者的血液样本。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。研究方案已获西安市红会医院的人类研究伦理委员会批准（批准号：201712003）。采用CD4 德国贝尔吉施格拉德巴赫（Miltenyi Biotec GmbH，MB）进行阳性选择，分离CD4+T细胞，借助人CD4+T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec GmbH）进一步纯化。通过流式细胞术对CD4+T 细胞富集（细胞纯度＞95%）。将纯化的CD4+T 细胞以2×106/mL 的浓度接种到24 孔板中，用含10%的胎牛血清（FBS）RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，美国）培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待其细胞融合度达85%以上时，分别用含地西他宾（Selleck Chemicals，美国，终浓度0.25µg/mL）[7]RPMI 1640培养基或NOTCH信号抑制剂NOTCH 通路抑制剂（Selleck Chemicals，终浓度75 µmol/L）[8]RPMI 1640p 培养基刺激了CD4+T 细胞96 h。随后收获细胞和上清液，其中NOTCH 通路抑制剂主要抑制NOTCH 1 信号的传导。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 为分析在抗TNF 治疗前后JIA中发生的遗传学变化，本研究采用GSE89252和GSE89251 进行全基因组甲基化和表达谱分析。采用R 软件（MacOS 版本）中的CHAMP（版本3.2）和limma软件包（版本3.0）来探讨T0组和Tend组中JIA 的基因甲基化和表达水平，并将结果显示在热图中以便于进一步筛选及验证。

1.2.2 甲基化特异性PCR（MSP）分析 分别从T0组与Tend 组患儿中提取CD4+T 细胞，并使用InvitrogenTM试剂盒（Thermo Fisher Scientific）提取两组患儿细胞的基因组DNA。取EpiTect亚硫酸盐试剂盒（QIAGEN，德国）来修饰DNA，然后用GenElute™哺乳动物基因组DNA 微量制备试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）进一步纯化DNA，应用琼脂糖凝胶电泳进行甲基化和非甲基化引物扩增，引物序列见表1。

表1 甲基化及PCR引物序列情况

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）采用TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）提取两组患者的总RNA。通过Takara RNA PCR试剂盒（Takara，中国）进行逆转录。然后使用SYBR Green 检测系统（Takara），采用RT-qPCR 用于定量NOTCH2的表达水平。内参基因为GAPDH，使用2-ΔΔCt公式计算相对表达量检测。以上所有操作均严格按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 酶联免疫吸附法（ELISA）采用人ELISA试剂盒（R＆D 公司，美国）测定T0、Tend 两组患儿CD4+T细胞上清液中的IL-4和IL-8表达情况。

1.2.5 细胞活力检测（MTT法）取T0组和Tend组对数生长期CD4+T 细胞，将以5×103个/mL 的细胞浓度接种到96 孔板中，用10%的胎牛血清（FBS）RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，美国）培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。次日获得基线MTT 光密度（OD），获得OD 值标的时间记为0 h。随后分别依次加入20 μL 含不同浓度地西他宾的RPMI 1640 培养基，其浓度范围为0～4 μmol/L，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h。待其结束后，采用MTT 法（Sigma-Aldrich）检测各浓度下CD4+T 细胞的增殖情况。并绘制细胞增殖曲线。

1.2.6 克隆形成 实验按照制造商的说明进行细胞计数试剂盒（MedChemExpress）分析，以分析细胞的增殖能力。将转染的细胞以每孔1×105个细胞的速度接种到各个平板孔中，然后与不同的处理方法（Con/ Decitabine/NOTCH2抑制剂）孵育48 h。随后，使用酶标仪（Bio-Rad，Hercules，美国）来研究570 nm的OD值。

1.2.7 免疫印迹分析（WB）采用RIPA 裂解液（上海碧云天）提取两组CD4+T细胞的总蛋白。每孔以30µg 总蛋白上样，借助十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Thermo Fisher Scientific）对其进行分离，采用湿法转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美国）上，采用一抗稀释液与4 ℃下孵育过夜。其一抗分别为：全人源NOTCH2多克隆抗体（1∶1 000）、全人源NICD 多克隆抗体（1∶1 000），全人源HES1 多克隆抗体（1∶1 000）和全人源GAPDH（1∶2 000）。次日采用TBST洗膜3次，每次10 min。随后用含辣根过氧化物酶标记的小鼠单克隆抗体（1∶5 000）于室温下共孵育1 h用TBST洗膜3 次，每次10 min。借助化学发光试剂盒ECL 显影并与暗室内曝光，采用Image J对其蛋白条带进行灰度值统计分析。GAPDH作为内参蛋白检测不同的处理条件下（Con/Decitabine/NOTCH 通路抑制剂/Decitabine+NOTCH 通路抑制剂）的各蛋白表达情况。

1.3 统计学方法

所有数据均采用EXCEL 进行数据录入，运用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量数据采用均数±标准差（）表示。符合正态分布且方差齐性检验合格后，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），与对照组T0组比较采用Dunnett 法分析；不符合则用非参数检验进行分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基化探针质量检测

通过多维定标法确定了1 000 个最易变的位置，显示了T0 和Tend 之间的差异聚类（图1A）。在395394探针的树状图中可以直观地发现JIA患儿的T0和Tend之间的区别（图1B）为Ⅰ型探针和Ⅱ型探针的结果与甲基化检测结果完全匹配，其中0 表示未甲基化部分，而其他表示基于β 值的甲基化部分（图1C），且每个样品的密度图表明本研究应用的数据具有较高质量（图1D）。

图1 甲基化探针质量检测

2.2 NOTCH2基因高甲基化导致JIA患儿IL-8表达降低

在图2A中鉴定出排名前20位的差异甲基化基因，表明Tend 组NOTCH2甲基化水平明显高于T0组（P＜0.05），而Tend 组中IL-8 的表达水平较T0 组低（图2B）。以上所有结果表明，经TNF治疗后JIA患儿中DNA被高甲基化，且与炎症相关的基因低表达。而且，被选为靶基因的NOTCH2具有与上述相同的甲基化状态，而细胞因子IL-8在Tend组中的表达较低，作为后续研究的目标因子。

图2 甲基化差异基因热图情况

2.3 NOTCH2甲基化程度及表达量检测

本研究通过MSP 以确认样本中NOTCH2的高甲基化导致其相应的表达水平。Tend 组样品在NOTCH2中显示出甲基化程度更高（P＜0.05）（图3A）。为了选择合适的浓度，本研究进行了地西他宾浓度筛选，发现地西他宾的最小有效剂量为0.25 μmol/L（图3B）。证实NOTCH2在Tend组CD4+T细胞系中是高度甲基化的，并且经地西他宾处理后可降低Tend组CD4+T细胞NOTCH2的甲基化水平（图3C）。RT-qPCR 检测结果表明，与T0 组相比，在Tend组中CD4+T细胞系的NOTCH2mRNA 表达更明显，NOTCH2抑制剂处理可下调了该基因的表达（P＜0.05）（图3D）。WB 检测结果显示，Tend 组中NOTCH2蛋白质表达明显高于T0组，且该现象在施加NOTCH2抑制剂后出现了明显下调，而地西他宾可逆转此现象（P＜0.05）（图3E～3F）。ELISA 检测结果发现，Tend组中细胞因子IL-8表达水平低于T0组，并且应用NOTCH2抑制剂处理后表达水平明显升高（P＜0.05）（图3G）。

图3 NOTCH2甲基化程度及各处理组表达情况检测

2.4 NOTCH2抑制剂及脱甲基抑制JIA患儿的细胞活性及细胞周期

MTT检测结果表明，NOTCH2低表达能够明显促进CD4 IL-8 T 细胞增殖（P＜0.05）（图4A～4B）。由细胞侵袭试验发现，与空白对照组相比较，Tend组和T0 组中NOTCH2抑制剂处理使侵袭细胞数下降，而Tend 组的迁移能力明显优于T0 组（P＜0.05）（图4C～4D）。此外，细胞活力检测中同样发现此现象且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4E～4F）。

图4 不同处理组细胞增殖能力及细胞周期情况

2.5 NOTCH 通路抑制剂抑制NOTCH 信号通路并影响细胞因子IL-8和IL-4

两组NOTCH 通路抑制剂处理可引起的NOTCH通路蛋白表达下调，且与其他3组相比均差异具有统计学意义（P＜0.05）（图5A～5B）。此外，地西他宾处理可使IL-8 的表达明显升高，而NOTCH 通路抑制剂处理可使IL-8 表达明显下调（P＜0.05），而地西他宾处理可使IL-4的表达明显下调，而NOTCH 通路抑制剂处理可使IL-4 表达明显上调（P＜0.05）（图5C～5D）。

图5 不同处理组NOTCH2信号通路表达情况及细胞因子变化情况

3 讨论

在本研究中，生物信息学分析的结果表明，与T0 组相比，在Tend 组CD4+T 细胞中NOTCH2为高甲基化基因，而Tend组中细胞因子IL-8 mRNA水平明显降低（P＜0.05）。应用NOTCH2抑制剂即脱甲基处理后可抑制CD4+T 的细胞增殖。此外，NOTCH 通路抑制剂处理可抑制NOTCH 信号通路并增加细胞因子IL-8表达，同时降低IL-4表达。

DNA甲基化可发生在基因的任何位置，可控制基因表达并维持基因组完整性，从而导致许多生物学过程，例如伤口愈合和纤维化，细胞周期调节，炎症/应激反应和凋亡[2]。DNA 甲基化具有一种称为DNA 脱甲基的逆反应，可以由DNA 甲基转移酶抑制剂地西他宾催化[9]。由于DNA 甲基化与许多生物学进展和疾病密切相关，因此DNA甲基化抑制剂地西他宾对于基于DNA 甲基化以探索这些疾病的发病机理的疾病研究具有重要意义。Cao等[10]指出地西他宾可能通过DNA 甲基化在Ldlr-/-小鼠中的动脉粥样硬化预防作用而对动脉粥样硬化的发展产生重大影响。吴萸等[11]的研究证实，MEK抑制剂增强了地西他宾对骨髓增生异常综合征患者的治疗作用。基于此，本研究不仅探讨了DNA甲基化对疾病的影响，而且还探讨了在抗TNF治疗退出之前和之后DNA甲基化对疾病的影响。

有研究显示腹膜炎患者的流出物中肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（sTWEAK）水平升高[12]。此外，在细胞之间介导趋化性（趋化性）的趋化因子有两个主要的亚类，即CC 和CXC[13]。作为促炎性趋化因子，IL-8 通过与CXC 趋化因子受体CXCR1 和CXCR2相互作用而主要吸引嗜中性粒细胞、单核细胞和细胞毒性T 细胞[14]。此外，有研究发现miRK10a 介导的原代内皮细胞中TWEAK 的敲低降低了IL-8和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的产生[15]。

本研究借助生物信息学分析JIA患儿基因组甲基化图谱，最终选择了NOTCH2作为目标基因进行进一步的体外研究，并检测了NOTCH 信号传导途径相关蛋白的表达情况，以初步探讨NOTCH2引起炎症的分子机制。有研究发现，NOTCH2可抑制PDGF-B 依赖性增殖，降低PDGF-B 的表达[16]。Huang 等[17]发现NOTCH2途径和miR-23b 在胃癌细胞的相互调节回路中相互作用，在胃癌发生中起重要作用。Galic 等[18]所述浆液上皮性卵巢癌的低分化组织学可能与NOTCH2表达水平降低有关。而有关NOTCH2在JIA患者中表达的报道较少。本研究发现,在JIA 经抗TNF 治疗后NOTCH2高度甲基化。同时，NOTCH2的去甲基化可抑制JIA 患儿CD4+T 细胞的增殖，上调了IL-4 的表达，降低IL-8的表达水平。

本研究的局限性在于所有实验都是在细胞中进行的，缺乏体内实验证据，因此我们没有足够的结果来确定NOTCH2和JIA 之间的关系。此外，在选择目标基因和信号通路时，本研究只选择了一个目标基因和两个通路，而其他基因或通路未进行检测。本研究发现NOTCH2对JIA 进展发挥关键作用，为临床JIA 的深入研究和临床治疗提供一个新的思路。