胃癌外泌体MiR-221靶向PTEN促进肿瘤相关成纤维细胞的形成*

马丽丽，苏 莹，柳 江

（新疆维吾尔自治区人民医院肿瘤科，乌鲁木齐 830000）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国胃癌死亡率位居恶性肿瘤死亡率第5 位。目前，胃癌的主要治疗方式仍然为手术治疗，但是患者术后5 年生存率低于25%。大多数胃癌的发病机制复杂，发展过程受多种因素影响[1-3]。所以，探究更多胃癌的发生发展机制对于胃癌的治疗至关重要。肿瘤微环境组分复杂，外泌体为肿瘤细胞分泌的携带遗传物质的纳米级囊泡，可调控肿瘤微环境中的血管内皮细胞、免疫细胞、基质细胞、肿瘤干细胞等[4-5]，其中，外泌体miRNA 调控肿瘤相关成纤维细胞的形成已经在多种肿瘤中被报道，如肺癌外泌体miR-1247-3p可调控肿瘤相关成纤维细胞的形成，肝癌外泌体miR-21 促进肿瘤相关成纤维细胞的形成而诱导肝癌的转移[6-7]。MiR-221 激活A20/c-Rel/CTGF 信号通路而促进乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞的形成[8]，并且在胃癌中高表达[9]。本文旨在探讨miR-221 在胃癌外泌体中的表达及外泌体miR-221对肿瘤相关成纤维细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人成纤维细胞HKF，人胃黏膜细胞GES-1，人胃癌细胞株MGC-803、MKN45（购自美国ATCC 细胞库），脂质体LipofectamineTM 2000 试剂盒和Trizol试剂盒（购自美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR 试剂盒（购自TaKaRa 公司），MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、CD9、TSG101、CD63、PTEN、GAPDH、Anti-rabbit IgG（购自美国Cell Signaling Technology 公司），白介素（IL）-6、IL-1β的Elisa检测试剂盒（购自天津安诺瑞康生物技术有限公司）。

1.2 细胞培养

GES-1、MGC-803、MKN45、HKF细胞培养于含10%FBS 的DMEM 培养基中，取液氮保存的细胞，迅速融化后转移至细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养至汇合率达80%时进行细胞传代，隔天更换培养基。

1.3 外泌体的提取与鉴定

将各组肺癌细胞的培养基更换为含10%无外泌体FBS的DMEM培养基中，培养48 h后收集细胞培养液，3 000 g，4 ℃离心15 min，取上清；6 000 g离心40 min，取上清；10 000 g离心1 h，取上清；100 000 g离心1 h，收集沉淀即为外泌体，外泌体用400 μL无菌PBS 重悬，使用透射电镜观察外泌体的结构特征，western blotting 检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。

1.4 细胞分组与转染

将HKF 细胞分为GES-1 exo 组、MGC-803 exo组、MKN45 exo 组、PBS 组（分别与10 μg/mL 的GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo 和等体积的PBS 共孵育48 h），以及MGC-803/miR-NC exo 组和MGC-803/miR-221 exo 组（分别与10 μg/mL 的MGC-803/miR-NC exo和MGC-803/miR-221 exo共孵育48 h）。MGC-803 细胞分为miR-NC 组和miR-221mimic 组（使用LipofectamineTM 2000 试剂盒将miR-NC和miR-221mimic转染至MGC-803细胞）。

1.5 qRT-PCR检测mRNA表达

外泌体miRNA 的提取使用The exoRNeasy serum/Plasma Maxi Kit，细胞中RNA 提取使用Trizol试剂盒，根据miRNA cDNA Sythesis Kit 和Eva Green miRNA qPCR MasterMix 进行miRNA 的qRTPCR 反应，根据PrimeScriptTM试剂盒和PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 试剂盒进行mRNA 的qRT-PCR反应。使用2-ΔΔCT法计算相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物的序列

1.6 ELIAS检测细胞培养上清中IL-1β和IL-6的浓度

将各组细胞培养48 h 后收集细胞培养上清，根据ELIAS试剂盒说明书，在96孔板标准品孔中加入50 μL标准品，待测样品孔加入40 μL细胞上清液和10 μL 生物素标记抗体，然后各孔分别加入100 μL辣根过氧化物酶标记抗体，37 ℃孵育75 min 后，清洗5 次后，分别加入50 μL 显色剂Ⅰ/Ⅱ，避光反应15 min，每孔加入50 μL 终止液，使用酶标仪于450 nm波长处测吸光度，根据标准曲线计算IL-1β和IL-6浓度。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

数据库预测miR-221 与PTEN 的结合位点，根据脂质体2000转染试剂盒，将PTEN野生型（pGL3-PTEN WT）和突变型质粒（pGL3-PTEN MUT）转染至293T 细胞，转染成功后，分别向上述细胞中转染miR-NC 和miR-221 mimic，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光强度。

1.8 Western blotting检测蛋白表达

RIPA试剂盒提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量后，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，使蛋白质充分变性，每组10 µg 蛋白上样进行SDS-PAGE 凝胶电泳，蛋白分离后转膜，PVDF 膜用5%脱脂牛奶封闭2 h后与一抗孵育过夜，洗膜后用1∶2 000比例稀释二抗室温孵育1.5 h，洗膜后用ECL 试剂盒显影，拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差（）表示，多组间差异使用方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌外泌体的鉴定结果

透射电镜观察外泌体结构显示，GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo具有双层膜结构，粒径在150 nm 左右并且表达外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌体的结构及生物学特征，见图1。

图1 外泌体鉴定结果

2.2 MiR-221高表达于胃癌细胞及其外泌体

与GES-1 细胞比较，MiR-221 在MGC-803 和MKN45 中的表达显著增加（均P＜0.001），与GES-1 exo 比较，MGC-803 exo、MKN45 exo 中miR-221表达显著增加（均P＜0.001），见图2。

图2 qRT-PCR鉴定miR-221表达

2.3 胃癌外泌体促进肿瘤相关成纤维细胞的形成

与GES-1 exo 组细胞比较，MGC-803 exo 组和MKN45 exo 组HKF 细胞中肿瘤相关成纤维细胞MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达显著上调（P＜0.001），肿瘤相关成纤维细胞特异性细胞因子IL-1β、IL-6 表达显著上调（P＜0.001），细胞上清中IL-1β和IL-6浓度显著增加（P＜0.01），见图3。

图3 外泌体对肿瘤相关成纤维细胞相关标志物表达和分泌的影响

2.4 外泌体miR-221 促进肿瘤相关成纤维细胞形成

在MGC-803 细胞中转染miR-221 mimic 以及miR-NC，提取转染后细胞分泌的外泌体miR-221 exo 和miR-NC exo，与miR-NC exo 组比较，miR-221 exo组中miR-221表达显著上调（均P＜0.001），将miR-NC exo和miR-221 exo与HKF细胞孵育，与miR-NC exo 组比较，miR-221 exo 组HKF 细胞中MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达显著上调（P＜0.001），IL-1β、IL-6 表达显著上调（均P＜0.001），细胞上清中IL-1β 和IL-6 浓度显著增加（均P＜0.001），见图4。

图4 外泌体miR-221对肿瘤相关成纤维细胞相关标志物表达和分泌的影响

2.5 PTEN为miR-221的靶基因

MiRDB数据库预测PTEN与miR-221结合位点如图5A 所示，双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，pGL3-PTEN WT 组293T 细胞转染miR-221 mimic 后其荧光强度显著低于转染miR-NC 组细胞（P＜0.001），pGL3-PTEN MUT 组293T 细胞转染miR-221 mimic 与miR-NC 后荧光强度无显著变化。并且与miR-NC组比较，miR-221 mimic组HKF细胞中PTEN表达显著下调（P＜0.001），与miR-NC exo 组比较，miR-221 exo 组PTEN 表达显著下调（P＜0.001），见图5。

图5 PTEN为miR-221靶基因

2.6 外泌体miR-221抑制PTEN表达而促进肿瘤相关成纤维细胞的形成

qRT-PCR 检测结果显示，与miR-NC exo 组比较，miR-221 exo组HKF细胞MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达显著上调（P＜0.001），IL-1β、IL-6表达显著上调（P＜0.001），细胞上清中IL-1β和IL-6浓度显著增加（P＜0.001），而与miR-221 exo组比较，miR-221 exo+PTEN 组细胞中MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达显著下调（P＜0.001），IL-1β、IL-6 表达显著下调（P＜0.001），细胞上清中IL-1β和IL-6浓度显著降低（P＜0.001），见图6。

图6 外泌体miR-221调控PTEN对肿瘤相关成纤维细胞相关标志物表达和分泌的影响

3 讨论

恶性肿瘤的治疗以及预后评价大多聚焦于肿瘤本身，近年来，肿瘤微环境中的各类细胞在肿瘤治疗和预后评估等临床行为中的价值受到了越来越多的关注。肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移的复杂的网络环境，肿瘤微环境组成复杂，包括肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞、基质细胞、成纤维细胞等细胞组分[10-11]，也包括细胞因子、胞外基质、胞外囊泡等，肿瘤微环境中可调控肿瘤的生长、转移、血管新生、免疫逃逸等病理过程[12-13]。肿瘤外泌体是肿瘤细胞分泌的纳米级囊泡，粒径在30～150 nm之间，内含多种遗传物质，其中miRNA是外泌体中的重要内含物之一[14]，外泌体miRNA可通过多种途径调控肿瘤微环境中的血管生成、肿瘤相关成纤维细胞的形成、肿瘤相关巨噬细胞的形成[15]。如乳腺癌外泌体miR-9可诱导肿瘤相关成纤维细胞的形成[16]，黑色素瘤外泌体miR-155-5p激活SOCS1/JAK2/STAT3 通路而促进肿瘤相关成纤维细胞的形成[17]，肺癌外泌体中miR-210调控JAK2/STAT3信号通路而促进肿瘤相关成纤维细胞的形成[18]，肝细胞癌衍生的外泌体中miRNA-21 通过靶向PTEN从而激活PDK1/AKT 通路进而促进肝癌进展[19]。MiR-221激活A20/c-Rel/CTGF信号通路而促进肿瘤相关成纤维细胞形成[8]，但是miR-221 以及外泌体miR-221对胃癌肿瘤相关成纤维细胞的影响尚未见相关研究。

肿瘤细胞外囊泡通过诱导肿瘤相关成纤维细胞中的趋化因子促进基质异质性[20]，胃癌外泌体miR-27a促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化[21]。本研究发现，胃癌细胞MGC-803 exo 和MKN45 exo 可促进肿瘤相关成纤维细胞的标志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达，以及特异性细胞因子IL-1β 和IL-6 的表达，说明胃癌外泌体具有调控肿瘤相关成纤维细胞的形成。

MiR-221可通过激活Wnt/β-catenin信号通路而促进三阴性乳腺癌的发展[22]，miR-221 可靶向抑制SOCS3 而影响胃癌的增殖和凋亡[23]。本研究发现，miR-221在胃癌细胞MGC-803和MKN45及其外泌体中高表达，外泌体miR-221 可促进肿瘤相关成纤维细胞的标志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin 表达，以及特异性细胞因子IL-1β 和IL-6 的表达，即促进肿瘤相关成纤维细胞的形成。

MiR-221 可靶向PTEN/PI3K/AKT 信号通路而影响卵巢癌的化疗耐药[24]，miR-221也可靶向PTEN而诱导骨肉瘤的生长和转移[25]，PTEN 亦可抑制肿瘤相关成纤维细胞的形成[26]，肝癌外泌体通过抑制PTEN的表达而促进肝形状细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化[19]。MiRNA 的调控机制是结合与其靶基因mRNA 的3'UTR 区域，而抑制靶基因的翻译。本文通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-221可靶向结合PTEN mRNA，PTEN为miR-221的靶基因，并且外泌体miR-221可抑制PTEN的表达，HKF细胞与miR-221exo 孵育后转染PTEN 质粒，其肿瘤相关成纤维细胞的标志物MMP-9、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表达，以及特异性细胞因子IL-1β和IL-6的表达均显著低于miR-221 exo组，进一步证明了外泌体miR-221是通过靶向PTEN而促进肿瘤相关成纤维细胞的形成。

综上所述，胃癌外泌体中miR-221 可通过抑制PTEN 的表达而促进肿瘤相关成纤维细胞的生成，为胃癌发病机制的探究提供了一定的理论依据，但是本文尚存在一定的局限性，并未进一步探究诱导后的肿瘤相关成纤维细胞对胃癌的影响。已有研究表明，外泌体miR-1247-3p 诱导的肿瘤相关成纤维细胞可促进肺癌的转移[27]，乳腺癌外泌体miR-146a 可诱导肿瘤相关成纤维细胞的形成而促进乳腺癌的迁移和侵袭[28]，因此，本研究将胃癌外泌体miR-221诱导的肿瘤相关成纤维细胞对胃癌转移的影响作为后续的研究方向。