白杨素对7-酮基胆固醇诱导的巨噬细胞炎症及脂代谢紊乱的影响*

胡子旋，蔡大可，李钰婷，赖亦静，甘海宁，姚 楠，黄丹娥，黄雪君，陈玉兴

（1.广东省中医药工程技术研究院，广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广州 510095；3.广东广州中医药大学第五临床医学院，广州 510405）

动脉粥样硬化（AS）导致的心血管疾病在全球范围内有较高的发病率和死亡率，经常引起中风、心肌梗死，甚至猝死等。脂质代谢失调和不良免疫反应是引起AS 的主要原因[1]。这一过程中血管内皮损伤导致氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）皮下聚集引起慢性炎症反应，脂蛋白长期沉积在动脉中，巨噬细胞未能清除多余的胆固醇而转化为载脂的泡沫样细胞，泡沫细胞是AS 病变的一个标志[2-3]。由此可见，ox-LDL 诱导巨噬细胞的炎症激活和发生，从而促进AS 的形成，但ox-LDL 在巨噬细胞中诱导炎症激活和炎症发生的确切机制尚不完全清楚。7-酮基-胆固醇（7-keto-cholesterol,7-KC）是ox-LDL中干扰巨噬细胞脂质代谢的主要成分，同时易引起内皮损伤促进炎症反应，常被用于诱导炎症表型和高脂负荷的巨噬细胞[4-5]。白杨素广泛存在于蜂蜜、蜂胶和天然植物提取物中，并发挥抗炎、抗氧化等药理活性[6]。有报道称，白杨素可降低裸鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α 和甘油三脂水平，具有急性降血脂作用[7]。此外，在饮食诱导形成的大鼠AS 模型中，白杨素能降低血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，在慢性环境下表现出抗AS的潜能[8]，成为预防和治疗AS 很有希望的候选药物，但其对炎症反应和胆固醇代谢调节的分子机制仍需进一步探索。因此，本研究采用7-KC造模，模拟AS 发病过程中氧化胆固醇致病原理，探究白杨素对7-KC所致巨噬细胞产生炎症和脂质代谢紊乱的干预作用，并探讨其发挥抗炎调脂作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器 多功能酶标仪（ThermoFisher）；细胞培养箱（ThermoFisher）；CKX41型倒置显微镜（奥林巴斯）；IQ5 荧光定量PCR 仪（ThermoFisher）；Power-Pac Basic 电泳仪（Bio-Rad）；湿转转模仪（Gen-Script）；Tanon 5200 Multi 多功能成像系统（上海天能）。

1.2 材料来源 纯度为98.5%的白杨素（BW5648）购自北京坛墨质检科技有限公司；瑞舒伐他汀（44180518）购自鲁南贝特制药有限公司；7-KC（CY18951）购自上海凯梅根生物公司；MEM-alpha高糖培养基（8119219）、青-链霉素（2185224）、胰蛋白酶（2186960）购自美国Gibco 公司；胎牛血清（1909A）购自澳大利亚Bovogen 公司；噻唑蓝（MTT）（JT343）购自北京鼎国昌盛有限公司；RNAev 试剂（A1A1039）购自湖南艾科瑞生物有限公司；RIPA裂解液（20200928）购自北京索莱宝有限公司；二甲基亚砜（DMSO）（EB26BA0032）购自上海生工生物工程有限公司；实时荧光定量PCR（RTqPCR）试剂盒（1909670A）购自日本Takara 公司；一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（S0021）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（RB230506）购自上海碧云天生物技术有限公司；一抗actin（ab8227）、SR-B1（ab217318）、P65（ab86299）、iNOS（ab3523）和二抗Rb（ab97051）、Ms（ab97023）购自艾博抗贸易有限公司。

1.3 细胞培养与分组 RAW264.7细胞株购自上海中科院细胞库。RAW264.7细胞置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，于含有10%胎牛血清与1%青—链霉素的MEM-alpha 培养基中培养。取对数生长期的细胞进行细胞分组，空白组只加MEM-alpha 培养基，模型组加入含2 μg/mL 7-KC的MEM-alpha培养基，瑞舒伐他汀组加入含2 μg/mL 7-KC 和1 μmol/L瑞舒伐他汀的MEM-alpha培养基，白杨素高剂量组加入含2 μg/mL 7-KC 和5 μmol/L 白杨素的MEMalpha培养基，白杨素中剂量组加入含2 μg/mL 7-KC和1 μmol/L白杨素的MEM-alpha培养基，白杨素低剂量组加入含2 μg/mL 7-KC 和0.1 μmol/L 白杨素的MEM-alpha 培养基，每组3 个平行孔。待细胞贴壁生长24 h后收集细胞及上清液。

1.4 MTT法细胞活性检测 杨素纯度为98.5%，摩尔质量为254.24，称取9.6 mg 的白杨素溶于185 μL DMSO 溶液，配成200 μmol/L 的白杨素溶液。调节RAW264.7 细胞浓度为104/mL 孔接种于96 孔板，用不同浓度白杨素（0 μmol/L、1.56 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L）孵育细胞24 h后，每孔加入20 μL MTT 染料处理12 h，然后与150 μL DMSO 混合培养5 min，用酶标仪检测在570 nm波长下各孔的OD值，计算存活率。

1.5 NO含量检测 细胞给药处理24 h后收集上清液，根据NO试剂盒说明书步骤操作，用多功能酶标仪在540 nm 波长下检测OD 值，做标准曲线，计算NO的含量。

1.6 RT-qPCR 法检测相关基因mRNA 的表达 细胞给药处理24 h后弃去上清，RNAev试剂处理细胞样品，提取总RNA，按照TaKaRa公司PCR试剂盒说明书操作逆转录获得cDNA，使用TB Green 法加入引物，以94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；5 ℃，30 s；72 ℃，50 s（45 个循环）；72 ℃，7 min 进行扩增，采用2-ΔΔCT法计算基因表达量。基因引物由上海英潍捷基公司合成，引物信息见表1。

表1 扩增的基因引物信息

1.7 Western blotting 检测相关蛋白的表达 细胞给药处理24 h后弃去上清，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度后，95 ℃下使蛋白煮沸变性。取等量总蛋白通过电泳转膜过程分离蛋白并转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗（NF-κB P65 1∶1 000、SR-B1 1∶2 000、iNOS 1∶500）过夜，洗涤，孵育二抗（兔抗1∶10 000），洗涤，自动成像系统曝光显影后进行半定量检测分析。

1.8 统计学方法 所有数据使用IBM SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Dunnett T3 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 法检测RAW264.7 细胞存活率 随着白杨素浓度的增加，细胞存活率逐渐下降；0～6.25 μmol/L 白杨素浓度范围内，RAW264.7 细胞存活率大于90%，与空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。因而在该范围内选取5 μmol/L、1 μmol/L和0.1 μmol/L浓度进行药物机制研究。

图1 白杨素对RAW264.7细胞存活率的影响

2.2 白杨素对RAW264.7细胞NO分泌的影响 与空白组相比，模型组上清液中NO 分泌量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，白杨素高、中、低剂量组NO 分泌量均显著降低（均P＜0.05），见表2。提示白杨素可抑制7-KC 诱导的RAW264.7 细胞分泌NO。

表2 白杨素对RAW264.7细胞NO分泌的影响 μmol/L，，n=3

表2 白杨素对RAW264.7细胞NO分泌的影响 μmol/L，，n=3

与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

2.3 白杨素调控RAW264.7 细胞炎症及脂代谢相关基因的表达 与空白组相比，模型组中ABCG1、LXRα、IL-17A、IL-10的mRNA表达显著降低（均P＜0.05），IL-6、Mcp-1的mRNA 表达显著升高（均P＜0.05）。与模型组相比，白杨素高剂量组中ABCG1、LXRα、IL-17A、IL-10表达显著上调（均P＜0.05），IL-6表达显著下调（P＜0.05）；白杨素中剂量组中LXRα、IL-17A、IL-10表达显著上调（均P＜0.05），IL-6、Mcp-1表达显著下调（均P＜0.05）；白杨素低剂量组中IL-10表达显著上调（P＜0.01），见图2。

图2 白杨素调控RAW264.7细胞炎症及脂代谢相关基因的表达

2.4 白杨素调控RAW264.7 细胞炎症及脂代谢相关蛋白的表达 与空白组相比，模型组NF-κB P65、iNOS 蛋白表达量显著升高（均P＜0.05），SR-B1 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，白杨素高剂量组NF-κB P65 蛋白表达量显著降低（P＜0.01），SR-B1 表达量明显升高（P＜0.01）；白杨素中、低剂量组NF-κB P65、iNOS 蛋白表达量显著降低（均P＜0.05），见图3。

图3 白杨素调控RAW264.7细胞炎症及脂代谢相关蛋白的表达

3 讨论

脂代谢紊乱及炎症反应是AS的两个关键致病因素，其中炎症能够进一步触发脂质代谢紊乱，是导致现有调血脂药物对AS 治疗并不理想的原因。因此，抑制炎症为抗AS 药物研发提供新的思考和策略。在AS 发展过程中，胆固醇逆向转运机制（RCT）是机体清除血液中过剩胆固醇的重要途径[9]。研究显示，三磷酸腺苷结合盒转运酶Abcg1和清道夫受体SR-B1 参与调控RCT 过程所发挥的重要作用，Abcg1 可作为RCT 的关键限速酶，促进粥样斑块中的胆固醇转移至巨噬细胞内，并通过肝脏代谢成胆汁酸排出体外[10]；SR-B1 可选择性结合ox-LDL 进入巨噬细胞吞噬清除，促进胆固醇外流[11]。据报道核受体超家族成员肝X 受体LXR 被激活后可作用于Abcg1、SR-B1，PPRAg/LXRα-Abcg1通路上调能降低小鼠血清ox-LDL水平[12]；而在小鼠肝脏中，LXRα可与SR-B1基因启动子结合，调控SR-B1的转录活性[13]。本研究结果显示，7-KC导致巨噬细胞中Abcg1 和SR-B1 的表达水平下降（P＜0.05），推测7-KC 可能通过调控脂代谢转运酶的表达从而影响RCT，而白杨素能逆转7-KC 诱导的Abcg1的mRNA 和SR-B1 的蛋白表达抑制，调节7-KC 所致的脂质代谢紊乱。同时，白杨素能上调LXRα的mRNA表达水平（P＜0.05），提示白杨素调节脂质代谢的作用靶点可能与其上游的PPRAs/LXRα通路有关。但是确切的LXR调控作用仍需后续深入的研究来证实。

高胆固醇血症可增加ox-LDL 的浸润和滞留，从而通过释放促炎因子激活内皮细胞和炎性细胞引起慢性炎症[14]。已有的研究表明，炎症基因的诱导表达是通过多重分子机制介导产生，如MAPK信号转导通路、PI3K-Akt 通路和NF-κB 调控通路[4,15]。其中NF-κB可被血管内炎症反应激活，并作为关键的转录因子调控各种炎症介质如NO、IL-1β、IL-6等[16]。本实验中，7-KC导致巨噬细胞的炎症信号通路级联反应，即NF-κB的激活以及下游一氧化氮合酶iNOS 的转录、翻译以及外排水平的诱导性表达。白杨素干预后，iNOS的蛋白表达降低从而使细胞外NO 的分泌下调，且白杨素干预后巨噬细胞趋化因子MCP-1、促炎因子IL-6 mRNA 表达下降，调节因子IL-10、IL-17A表达水平上升，表明白杨素具有明显抗炎活性。iNOS 和促炎因子作为NF-κB 通路下游的靶蛋白和靶基因，其转录翻译受到NF-κB的调控，提示白杨素的抗炎分子机制可能与NF-κB通路有关。由于NF-κB常以P50/P65二聚体形式存在，且P65具有增强调控基因转录活性的作用[17]，本实验检测了NF-κB P65蛋白的表达。本研究结果显示，7-KC 刺激了P65 蛋白表达，白杨素处理后可显著降低P65 蛋白水平，并呈现剂量依赖性的抑制NF-κB的激活（P＜0.05），提示白杨素可能通过抑制NF-κB调控的炎症通路缓解AS的发展。

综上，白杨素可能通过调控NF-κB通路来发挥调脂抗炎功能，其靶点可能为NF-κB与LXR相互作用的关键蛋白HDAC、STAT3等，这些蛋白的调控可能成为调血脂潜在新靶点。鉴于白杨素的特点及本实验研究的发现，以HDAC、STAT3为分子靶标筛选的策略，为优化白杨素调血脂药效和抗炎提供依据，从而进一步提高其对AS疾病的疗效。