直肠癌组织中BRG1的表达及其与病理特征和预后的关系

赵 楠 魏 东 高春芳

(中国人民解放军联勤保障部队第989医院结直肠乳腺疝外科 洛阳 471000)

直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率呈逐年升高趋势和年轻化趋势。直肠癌的病理进程是一个涉及多因素、多阶段、多基因的过程，遗传因素、饮食因素与疾病的转归有关，原癌基因激活、抑癌基因失活也与疾病的发展有关。迄今为止，在直肠癌病理进程中发挥关键作用的基因仍未阐明。BRG1(Brahma-related gene1)是近年来新发现的具有肿瘤抑制作用的基因，其编码产物参与哺乳动物细胞内SWI/SNF复合物的组成，SWI/SNF复合物能够通过表观遗传学调控、染色质重构、基因转录活性改变等途径来调节基因表达，进而发挥抑癌活性[1～2]。已有多项研究报道，BRG1在结直肠癌、宫颈癌、胃癌组织中呈低表达趋势[3～5]，但关于BRG1与直肠癌病理特征及预后的关系尚未明确。本研究具体分析了直肠癌组织中BRG1表达情况及其与病理特征、预后的相关关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选择2015年8月～2019年6月期间我院手术切除的直肠癌标本，均经术后病理确诊，共62例，TNM II期30例、III期32例，高分化28例、中低分化34例，合并淋巴结转移24例。所有患者术前均未接受放化疗。即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP检测试剂盒购买于福建迈新生物公司，BRG1免疫组化抗体购买于Santa Cruz公司，超纯RNA提取试剂盒、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture试剂购买于北京康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1BRG1表达情况的测定

取石蜡包埋的直肠癌组织，制作病理切片后采用即用型免疫组化超敏检测试剂盒对BRG1进行染色，在高倍镜选取多个视野进行观察，细胞核呈棕黄色颗粒为BRG1阳性。0%～25%细胞阳性为1分、26%～50%细胞阳性为2分、51%～75%细胞阳性为3分、76%～100%细胞阳性为4分；细胞无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。两项乘积0～4分为低表达、6～16分为高表达。

1.2.2增殖基因表达的测定

取液氮冷冻的直肠癌组织，采用超纯RNA提取试剂盒提取组织中的RNA后采用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒将其合成为cDNA；取cDNA 1μL与UltraSYBR Mixture试剂10μL、引物混合物0.8μL、去离子水8.2μL混合后进行PCR反应，反应程序如下：95℃ 20s、特异性退火温度 15s、72℃ 25s，重复40个循环。基因引物序列、退火温度如表1所示。根据扩增曲线得到循环阈值，以β-actin为内参，计算CyclinB1、CyclinE、p21、p27的mRNA表达量。

表1 基因引物序列及退火温度

1.2.3随访

术后每3个月进行1次随访，随访方式包括电话随访、门诊随访、住院复查等，随访内容包括是否复发、复发时间、生存时间等，随访截止日期为2021年1月、随访时间19～65个月。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同病理特征的直肠癌组织中BRG1的表达情况

TNM III期直肠癌组织中BRG1的高表达率低于TNM II期直肠癌组织，中低分化直肠癌组织中BRG1的高表达率低于高分化直肠癌组织，有淋巴结转移的直肠癌组织中BRG1的高表达率低于无淋巴结转移的直肠癌组织，见表2。

表2 不同病理特征的直肠癌组织中BRG1的表达情况

2.2 不同BRG1表达情况的直肠癌组织中增殖基因的表达量

BRG1高表达的直肠癌组织中CyclinB1、CyclinE的mRNA表达量明显低于BRG1低表达的直肠癌组织，p21、p27的mRNA表达量明显高于BRG1低表达的直肠癌组织，见表3。

表3 不同BRG1表达情况的直肠癌组织中增殖基因的比较

2.3 不同BRG1表达情况的直肠癌患者的预后情况

直肠癌组织中BRG1高表达的患者的无病生存时间、总生存时间均长于BRG1低表达的患者，见表4；BRG1高表达的患者5年总体生存曲线高于BRG1低表达的患者，见图1。

表4 不同BRG1表达情况的直肠癌患者的生存时间比较

图1 不同BRG1表达情况的直肠癌患者的生存曲线

3 讨论

直肠癌的发生及发展过程涉及多因素、多阶段、多基因，探明在该过程中起到关键作用的基因有助于发现疾病治疗的新靶点。SWI/SNF复合物所介导的染色质重塑过程在基因转录调控中起到重要作用，越来越多的研究表明恶性肿瘤进程中伴有SWI/SNF复合物功能的减弱[6～7]。BRG1、BRM、SNF5、BAF155等是参与SWI/SNF复合物组成的分子，其中BRG1具有DNA依赖的具有ATP酶活性的类解旋酶亚基，在细胞增殖、迁移、侵袭等过程中均起到调控作用[8]。国内外多项研究证实，BRG1具有抑癌基因活性且在多种恶性肿瘤病灶内呈低表达趋势[3～5]。在国内外其他学者研究的基础上，本研究分析了不同病理特征的直肠癌组织中BRG1表达量的差异，TNM III期、中低分化、有淋巴结转移的直肠癌组织中BRG1的高表达率明显降低。这一结果提示BRG1的低表达不仅与直肠癌的发生有关，还参与直肠癌的病理进程，与肿瘤分期的进展、分化程度的降低、淋巴结的转移均存在密切关系。

BRG1主要通过阻碍细胞增殖来发挥抑癌基因活性，细胞内多种增殖基因的表达过程受到BRG1的调控。CyclinB1和CyclinE是细胞周期的正性调控分子，通过与各自的激酶形成复合体来促进细胞跨过细胞周期检查点，进而加速细胞周期进程、促进细胞增殖[9]；p21和p27是细胞周期的负性调控分子，能够抑制多种细胞周期蛋白激酶与Cyclin形成复合体，进而使细胞周期发生停滞、细胞增殖受到抑制[10]。为了进一步明确BRG1低表达在直肠癌病理进程中的作用，本研究分析了不同BRG1表达量的直肠癌组织中上述增殖基因表达的差异，在BRG1高表达的直肠癌组织中，具有促增殖作用的CyclinB1、CyclinE呈低表达趋势，而具有增殖抑制作用的p21、p27呈高表达趋势。这一结果表明BRG1能够减少促增殖基因的表达、增加增殖抑制基因的表达，直肠癌病灶内低表达的BRG1能够使促增殖基因的表达上调、增殖抑制基因的表达下调，进而促进直肠癌病理进程的发展。

直肠癌患者手术后的病情转归及预后直接受到肿瘤病理特征的影响。在肿瘤分期越高、分化程度越低的直肠癌病灶内，癌细胞的增殖和侵袭活力越旺盛，更加容易发生远处微转移[11]；而在已经发生局部淋巴结转移的直肠癌病灶内，癌细胞已经发生了邻近组织结构的浸润，容易在手术后残留微小病灶[12]。直肠癌手术后微小转移病灶的残留是远期复发和转移的病理基础。前一部分的结果已经阐明病灶内BRG1的低表达与直肠癌的病理进程密切相关，为了进一步阐明BRG1异常表达与直肠癌预后的关系，本研究在手术后对患者的生存期进行了随访，直肠癌组织中BRG1高表达的患者的无病生存时间、总生存时间较长且5年总体生存曲线明显高于BRG1低表达的患者。这一结果提示直肠癌组织中BRG1的异常表达与直肠癌患者的预后直接相关，BRG1低表达患者的生存时间较短、预后较差。

综上所述，直肠癌组织中BRG1的低表达与病理进程发展、增殖活力加剧、生存时间缩短有关。