黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药胞株MCF-7/A 侵袭和迁移作用的影响

寇晓梅，柯永莉，李燕

乳腺癌是起源于乳腺的恶性肿瘤，一般高发于40～55 岁的女性，是女性常见的恶性肿瘤［1］。乳腺癌的早期症状不太明显，一旦被确诊，该病一般已经出现淋巴结转移的情况，严重地影响了患者的预后和生存情况［2］。乳腺癌的发生及发展是一个复杂的过程，是多种因素共同作用的结果，且环境和遗传因素发挥着主要作用，所以对于乳腺癌的早期诊断和治疗非常重要。目前针对乳腺癌的治疗主要有外科治疗、化学治疗、免疫治疗和靶向治疗等［3］，化学治疗在乳腺癌治疗方面仍然占据主要地位，但随着疗程的增加，化疗的效果不再理想，乳腺癌化疗成功的主要障碍就是化疗耐药。黄花蒿是一年生菊科草本植物，性寒、辛、味苦，主要用于泻热、消暑和汗等，在救治严重的脑型疟疾方面具有迅速、高效、低毒和使用方便的优点，是公认的治疗疟疾药物［4］。相关研究表明，青蒿素具有抗肿瘤、抗疟疾、抗真菌和免疫调节等多种的中药药理作用，具有潜在的应用价值［5］。但关于黄花蒿和乳腺癌耐药方面的相关报道较少，所以本研究探讨黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 增殖、侵袭和迁移作用的影响。报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料 乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，黄花蒿原草产于西安，DMEM 培养基购买于北京康碧泉生物科技有限公司，胰蛋白酶购买于天津市富宇精细化工有限公司，CCK-8 试剂盒购买于美国Gibco 公司，琼脂糖和RIPA 裂解液购买于碧云天生物技术研究公司。

1.2 药物制备 将1.5 kg 糯米浸泡后，放入缸中，然后蒸熟，拌入0.15 kg 的生物菌，在上面撒上薄薄的一层酒药，加盖保温，30 h 后酿液，降低缸内温度，促进发酵，按照一定的比例倒入冷水、然后切块和翻转。48 h 后放入米3 kg，黄花篙末3 kg 和加曲拌匀0.05 kg，继续发酵，再次加入微生物菌，96 h 后灌入小埕，扎好埕口，低养下发酵60 d，然后离心处理，过滤除菌，得到浓度为200 g/L 的酵解液备实验使用。

1.3 细胞培养和分组 将乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 制成细胞悬液，以1.5×109/L 接种于培养瓶中，在常温下培养24 h，观察细胞的增长情况，当细胞生长融合度高达80%～90%时，弃原培养基，进行胰酶消化，制成细胞悬液，冻存－80℃，待后续实验使用。将MCF-7/A 处理后细胞分为对照组、黄花蒿酵解液低剂量组（黄花蒿低剂量组）、黄花蒿酵解液中剂量组（黄花蒿中剂量组）和黄花蒿酵解液高剂量组（黄花蒿高剂量组），对照组不做任何处理，黄花蒿低剂量组中的MCF-7/A 细胞滴入10 g/L 的黄花蒿酵解液，黄花蒿中剂量组中的MCF-7/A 细胞滴入20 g/L 的黄花蒿酵解液，黄花蒿高剂量组中的MCF-7/A 细胞滴入30 g/L 的黄花蒿酵解液，黄花蒿酵解液作用于细胞72 h。

1.4 CCK-8 检测细胞增殖 使用CCK-8 试剂盒检测各组的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 增殖情况，MCF-7/A 细胞以1×104个/孔接种于96 孔板中，分别在24、48、72 和96 h 将CCK-8 溶液添加到每个孔中，37℃下孵育1 h，记录490 nm 的吸光度（OD）。

1.5 克隆形成实验检测细胞集落 处理后的各组乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 调整为1.0×103个/孔置于培养皿中培养，10 d 后采用结晶紫染色各组细胞，对大于50 个的细胞集落进行计数，并采用倒置显微镜拍摄集落形成的情况。

1.6 Transwell 法检测细胞侵袭和迁移 将各组处理后的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 以5×104个悬浮在无血清DMEM 培养基，在放入基底膜基质涂层的transwell 小室，胰酶消化，加入200 μL 含10% FBS的培养基，在37℃和5%CO2的培养箱中培养24 h，将穿透细胞膜的细胞采用100%甲醇固定，0.1%结晶紫染色10 min，PBS 洗去浮色，晒干，随机取3 个视野拍照，显微镜下观察，计算细胞迁移数量。取基质胶（matrigel）冰盒放冰上融化，将各组处理后的MCF-7/A 细胞置于matrigel 的小室内进行细胞培养，检测MCF-7/A 细胞侵袭能力，具体见迁移步骤。

1.7 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件处理，计数资料采用百分比（%）表示，实验数据资料数据采用均数±标准差（±s）表示，行方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A增殖能力的影响 与对照组相比，黄花蒿低剂量组、黄花蒿中剂量组和黄花蒿高剂量组中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与黄花蒿低剂量组相比，黄花蒿高剂量组中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A增殖能力的影响(± s)

表1 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A增殖能力的影响(± s)

注：与对照组比较aP＜0.05，与黄花蒿低剂量组比较bP＜0.05

细胞的增殖能力组别例数8 8 8 8给药量（g/L）0 10 20 30 24 h 0.27±0.03 0.24±0.02 0.23±0.01 0.21±0.02 5.573 0.029对照组黄花蒿低剂量组黄花蒿中剂量组黄花蒿高剂量组F 值P 值96 h 0.91±0.17 0.83±0.14a 0.73±0.07a 0.52±0.08ab 8.213＜0.01 48 h 0.71±0.09 0.62±0.07a 0.53±0.04a 0.34±0.05ab 6.174＜0.01 72 h 0.85±0.14 0.79±0.11a 0.61±0.06a 0.47±0.07ab 7.16＜0.01

2.2 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A集落形成的影响 与对照组相比，黄花蒿低剂量组、黄花蒿中剂量组和黄花蒿高剂量组的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 细胞集落形成能力明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与黄花蒿低剂量组相比，黄花蒿高剂量组的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A细胞集落形成能力显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 集落形成的影响（± s）

表2 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 集落形成的影响（± s）

注：与对照组比较aP＜0.05，与黄花蒿低剂量组比较bP＜0.05

组别对照组黄花蒿低剂量组黄花蒿中剂量组黄花蒿高剂量组集落形成（CFU-E）649.53±20.12 511.41±17.83a 397.82±15.27a 273.51±10.49ab例数8 8 8 8给药量（g/L）0 10 20 30

2.3 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A侵袭和迁移能力的影响 与对照组相比，黄花蒿低剂量组、黄花蒿中剂量组和黄花蒿高剂量组的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与黄花蒿低剂量组相比，黄花蒿高剂量组的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力的影响(± s)

表3 黄花蒿酵解液对乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力的影响(± s)

注：与对照组比较aP＜0.05，与对照组比较bP＜0.05

组别对照组黄花蒿低剂量组黄花蒿中剂量组黄花蒿高剂量组迁移数量（个/视野）119.57±10.26 98.69±8.63a 82.83±6.54a 46.94±3.75ab例数8 8 8 8给药量（g/L）0 10 20 30侵袭数量（个/视野）142.37±15.39 129.82±12.63a 118.74±10.06a 61.93±5.92ab

3 讨论

乳腺癌属于乳腺部位的恶性肿瘤，主要分为2大类，乳腺导管癌和乳腺的小叶癌，女性的围绝经期、45～55 岁和65～70 岁的女性发病率较高［6］。随着发病率的逐渐增高，乳腺癌已经成为女性常见的、多发的恶性肿瘤，居于女性恶性肿瘤发病率的首位。尽管较高的发病率，但致死率相对来说较低，目前乳腺癌的治疗已经形成一套比较综合的规范的治疗体系。乳腺癌发生在乳腺腺上皮组织，发病机制较为复杂，可能与内外源性激素、乳腺良性疾病、肥胖、遗传、放射暴露等因素相关［7］。尽管乳腺癌可以通过手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向等手段治疗，但仍然存在35%左右的患者出现复发转移的现象，最终导致死亡。

乳腺癌属于一种异质性高的恶性肿瘤，多线治疗后分子分型会发生改变，导致乳腺癌患者出现获得性耐药［8］。目前，乳腺癌的治疗仍然是以化疗为主，但治疗的过程中仍有一部分乳腺癌患者面临着多药耐药和无药可用的窘境。靶向治疗已经成为乳腺癌治疗的主要突破口，虽然靶向治疗针对性强，效果好，但仍有部分患者出现较强的不良作用［9］，给临床乳腺癌的治疗带来了一定的阻碍。所以寻找不良作用小的耐药逆转剂是目前迫切需要解决的问题。黄花蒿是一种草本菊科植物，黄花蒿的提取物能够提高免疫力、抗病毒、杀菌和抗氧化等功效［10］。相关研究表明，青蒿素通过抑制JAK2/STAT3 信号通路活化诱导肝癌细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用［11］，也有研究表明，青篙素衍生物可抑制宫颈癌细胞的体外增殖，促进癌细胞的早期凋亡［12］。

本研究结果表明，与对照组相比，低、中和高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A在48、72 和96 h 的增殖能力明显降低，与低剂量的黄花蒿酵解液相比，高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 在48、72 和96 h 的增殖能力显著降低。集落形成实验结果显示，与对照组相比，低、中和高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 细胞集落形成能力明显降低。与低剂量的黄花蒿酵解液相比，高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 细胞集落形成能力显著降低。Transwell 法检测细胞侵袭和迁移结果显示，与对照组相比低、中和高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力明显降低；与低剂量的黄花蒿酵解液相比，高剂量的黄花蒿酵解液中的乳腺癌耐药物胞株MCF-7/A 侵袭和迁移能力增殖能力显著降低。

综上所述，随着黄花蒿酵解液浓度的升高，MCF-7/A 细胞增殖、侵袭和迁移能力逐渐降低。