金荞麦胶囊体外抑菌实验*

童晓东，毛一鑫

1 南通市中医院（南京中医药大学南通附属医院） 江苏南通 226001

2 南京中医药大学药学院 江苏南京 210023

金荞麦为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys（D.Don） Ham的干燥根茎[1]。金荞麦治疗肺脓肿， 具有比较快的退热速度， 而没有抗生素常有的过敏反应和耐药性，有较高的痊愈率，作为首选药物用于治疗亚急性﹑急性肺脓肿[2-3]，研究表明金荞麦对枯草芽孢杆菌﹑金黄色葡萄球菌﹑大肠杆菌﹑肺炎球菌等具有抑制作用[4-6]。临床常用于呼吸系统感染[7-8]。

金荞麦胶囊为金荞麦的乙醇提取物而制成，本实验考察金荞麦胶囊的体外抑菌效果，以平皿稀释法初步研究金荞麦胶囊最低抑菌浓度，以牛津杯法考察研究金荞麦胶囊体外对大肠杆菌﹑乙型溶血性链球菌﹑铜绿假单胞菌﹑金黄色葡萄球菌抑菌活性，为临床应用提供依据。

材料与方法

1 仪器与材料

1.1 仪器 YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌器，SPX-250B-Z生化培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；BSC-1304IIA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；HT-100B台式恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司）。

1.2 试药 金荞麦胶囊（批号：20201206，本课题自制）；金荞麦合剂（批号：20201217，本院自制）；金荞麦片（批号：20201124，精华制药集团股份有限公司）；营养肉汁琼脂（批号：20201206，上海广锐生物科技）

1.3 菌种 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC™ 27853™，批号2021/03/16；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC™ 25923™，批号2021/03/31；大肠杆菌Escherichia coli ATCC™25922™，批号2021/03/09（Thermo Scientific）；乙型溶血性链球菌Streptococcus hemolytic-β CMCC（B）32210，批号210222（南通凯恒生物科技）。

2 试验方法

2.1 菌悬液的制备[9]取适量营养肉汁琼脂，加适量纯净水溶解，灭菌，置无菌培养皿中，放置室温备用。铜绿假单胞菌﹑乙型溶血性链球菌﹑金黄色葡萄球菌﹑大肠杆菌等标准菌株分别接种于营养肉汁琼脂培养皿中，培养48 h于35 ℃，置 4 ℃生物冷藏箱中备用，分别取出培养好的各菌种，用无菌接种铲刮下菌体，用无菌水稀释溶化，分别用无菌的0.9%氯化钠溶液按10倍逐级添加稀释上述各菌种培养液，制成各不同梯度稀释级的菌悬液。采用平板计数法测定含菌量， 105～106cfu/mL的菌悬液选为备用，置2～8 ℃生物冷藏箱保存。

2.2 金荞麦胶囊 MIC和MBC试验[10]将金荞麦胶囊用无菌水制备成100g/L质量浓度的母液。取10支小试管，灭菌， 1～10依次编号，原液分别用无菌蒸馏水固定倍量均匀稀释至9个浓度梯度，配制混合成各含金荞麦胶囊质量浓度为100﹑50﹑25﹑12.5﹑6.25﹑3.13﹑1.56﹑0.78﹑0.39g/L 的 系 列 药液，取18mL营养肉汁琼脂培养基与2mL各浓度的药液混均匀后平铺于无菌培养皿，制备成含各浓度的药液琼脂平板。10号管作为阳性对照管不加药液，9号管作为阴性对照管不加菌液。1至8号管﹑10号管分别加入0.1 mL菌悬液，将接种好菌液的琼脂平板浸干后置于35 ℃生化培养箱中培养18 h。分别做重复试验3 次，根据3次实验的结果，没有细菌生长的溶液的最大稀释度为最小抑菌浓度（MIC）， 没有菌落形成的溶液的最低浓度为最低杀菌浓度（MBC）。

2.3 牛津杯法测定金荞麦胶囊抑菌效果 将100μL铜绿假单胞菌﹑金黄色葡萄球菌﹑乙型溶血性链球菌﹑大肠杆菌菌液分别加入4个营养肉汁琼脂培养基上，涂布均匀，在平板中央放置已灭菌的牛津杯，分别牛津杯内加入200μL的 50mg/mL的金荞麦胶囊药液，为使药液均匀扩散于琼脂上，先置4℃冰箱中静置8h，再置生化培养箱中37℃培养18h。测量抑菌圈直径。每项菌种做3组，计算其平均值[11]。

结 果

1 金荞麦胶囊MIC和MBC试验结果

金荞麦胶囊对金黄色葡萄球菌﹑铜绿假单胞菌﹑乙型溶血性链球菌的MIC为12.5 g/L，大肠杆菌的MIC为25g/L；金荞麦胶囊对铜绿假单胞菌﹑金黄色葡萄球菌﹑乙型溶血性链球菌的MBC为50 g/L，大肠杆菌的MBC为100 g/L。见表1。

表1 金荞麦胶囊的 MIC﹑MBC

2 金荞麦胶囊的抑菌效果

根据美国临床实验室标准化委员会（ NCCLS /CLSI） CLSI M100抗微生物药物敏感性试验的执行标准第29版（2019）标准，抑菌圈试验的敏感判定标准为：抑菌圈低度敏感5～10 mm，中度敏感10～20 mm，最敏感直径为＞20mm，≤5 mm无抑制作用者为不敏感[11]。实验结果表明，金荞麦胶囊对金黄色葡萄球菌﹑铜绿假单胞菌﹑乙型溶血性链球菌为中度敏感，对大肠杆菌为低度敏感，其对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好。见图1﹑表2。

图1 金荞麦胶囊对供试菌的抑菌作用

表2 金荞麦胶囊对供试菌的抑菌圈的影响

讨 论

金荞麦胶囊是在我院获得国家级成果（国家二级甲等科技进步奖）“新药金荞麦”医院制剂金荞麦合剂的基础上研制而成。现代化学研究认为金荞麦主要含有黄酮类﹑甾体﹑萜类以及酚类等化学成分[13]，其中黄酮以及酚酸类化合物药理研究对乙型溶血性链球菌﹑肺炎球菌具有抑制作用，并且可以为肺炎球菌菌株所致的小鼠提供保护，尤以表儿茶素为其主要活性成分，（-）表儿茶素类活性物质对枯草芽孢杆菌﹑金黄色葡萄球菌﹑大肠杆菌等均有抑制作用。这为金荞麦治疗肺脓肿，及现在用于感染提供依据，金荞麦中生物类黄酮在体内及体外均有较强的抑菌活性，但提取方法的不同对金荞麦的抗炎﹑抑菌作用有明显影响，包鹏等认为金荞麦浸膏的体内体外没有抑菌活性， 在水提物和醇提物的抑菌活性体外研究中，乙醇提取物的抑菌活性较好， 不同浓度的乙醇提取物对动物主要体内致病菌群有不同程度的抑菌活性作用[14-17]。也有报道认为金荞麦根茎的乙醇提取物的体外抑菌作用优于水提和黄酒闷提的作用，而且对“金葡”“肺球”有较明确的抑制作用[18-20]。

金荞麦胶囊也具有清热解毒，排脓生肌。临床主要用于肺脓疡﹑扁桃体周围脓肿﹑麻疹肺炎。肺脓疡主要致病菌主要为肺炎克雷伯杆菌﹑铜绿假单胞菌以及大肠埃希菌等；革兰阳性菌主要为金黄色葡萄球菌和链球菌[17]。体外抑菌实验也支持其临床作用。金荞麦胶囊对金黄色葡萄球菌﹑铜绿假单胞菌﹑乙型溶血性链球菌的MIC为12.5 g/L，大肠杆菌的MIC为25g/L；金荞麦胶囊对铜绿假单胞菌﹑金黄色葡萄球菌﹑乙型溶血性链球菌的MBC为50 g/L，大肠杆菌的MBC为100 g/L，对临床金荞麦胶囊的使用量提供依据。金荞麦胶囊对铜绿假单胞菌﹑金黄色葡萄球菌﹑乙型溶血性链球菌具有明显的抑菌作用，对大肠杆菌抑菌作用较弱。可以替代金荞麦合剂在临床应用。

由于疫情原因，没有做肺炎链球菌﹑肺炎克雷伯杆菌的体外抑菌实验，但有王立波等对金荞麦乙醇提取物乙酸乙酯的萃取部分肺炎球菌有明显的抑制作用[21]，待以后进一步的研究。

牛津杯法测定金荞麦胶囊抑菌效果中金荞麦胶囊药液浓度的选择，因金荞麦胶囊是在金荞麦合剂基础上研制，金荞麦合剂的临床用量为40mL/次，按工艺换算为0.25g/mL的金荞麦原药材浓度，结合金荞麦胶囊的得膏率大约为20%，以金荞麦胶囊临床每次使用量为依据，确定牛津杯法测定金荞麦胶囊抑菌效果中金荞麦胶囊药液浓度为50mg/mL。