黄连等五种中药颗粒剂对鲍曼不动杆菌生物膜耐药性及相关基因的作用分析*

李晓君，邓超，谭俊青，林渝渠，赖韶钦，何宇巍

1 广东省第二中医院 广东广州 510095

2 中山大学南方学院 广东广州 510970

3 广州市登峰街社区卫生服务中心 广东广州 510095

鲍曼不动杆菌是一种非发酵型的革兰阴性条件致病菌，近年来报道显示，鲍曼不动杆菌的分离菌株数已超过铜绿假单胞菌，成为不发酵糖革兰阴性杆菌分离最多的菌[1-2]，在2018年CHINET监测结果显示，碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的检出率大于75%，因此被国内外知名专家列为目前重要的'超级细菌'，成为医学治疗中的一个严重问题[3]。

细菌生物膜是一种膜状细菌群体，生物膜的形成是鲍曼不动杆菌的重要耐药机制之一[4]，报道显示临床分离的鲍曼不动杆菌菌株有较强的生物膜形成能力[5]，细菌一旦形成生物膜，其对抗菌药物的敏感性大大降低，细菌将很难被杀灭[6]。

中药在抑杀菌方面有其独特的效果，中药颗粒剂作为新型中药制剂，并因其便捷﹑耐药性少的特点，迅速被接受。我们在前期的研究发现，黄连﹑黄芩﹑五味子﹑乌梅﹑连翘对CRAB具有良好的抑菌效果及抑膜作用[7-9]，为进一步探索相关中药颗粒剂抑膜机制，本实验拟通过琼脂糖凝胶电泳技术测定18对常见耐药基因以及MIC法测定药物敏感试验在药物作用前后的改变，以期在分子学的角度进一步探索中药颗粒剂抑菌的机制，为临床用药提供数据参考。

材料与方法

1 实验材料

1.1 菌株 收集广东省第二中医院检验科于2020年10月—2021年1月临床分离的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌，剔除同一病人分离的同一菌株，进行生物膜体外模型筛选实验，根据实验实际情况，使用结晶紫染色法观察细菌生物膜体外模型情况挑选出2株生物膜阳性菌株（命名为PF-Q，PF-R），1株生物膜阴性菌株进行实验（命名为PF-N）。

1.2 主要仪器与试剂 普通营养肉汤﹑血琼脂平板购于广州市迪景微生物科技有限公司。黄连﹑黄芩﹑五味子﹑乌梅﹑连翘5种中药颗粒剂均购于广东一方制药有限公司。主要仪器为法国梅里埃VITEK2全自动微生物鉴定/药敏仪，新加坡ESCO AC2-3S1生物安全柜，美国Bio-Rad IQTM5型荧光定量PCR仪。

2 检测方法

2.1 筛选实验菌株 使用结晶紫染色法进行染色，在低倍镜下观察生物膜形成，选择生物膜形成阳性的菌株作为实验菌株。

2.2 确定抑膜浓度 采用倍比稀释的方法检测CRAB的最小抑膜浓度。

2.3 耐药基因检测

2.3.1 DNA模板制备 按照细菌基因组DNA提取试剂盒，提取待测细菌基因组。

2.3.2 PCR扩增 引物序列参照表1，引物的设计合成擎科新业生物公司合成，使用rTaq酶配制25 μL的PCR 反应体系对目的基因进行扩增，反应体系：10×rTaq Buffer2.5μL，dNTP Mixture2.0μL，上游引物（10 μmol/mL）0.5μL，下 游 引 物（10 μmol/mL）0.5μL，rTaq（5 U/μL）0.125μL，DNA1.0。PCR运行参数为95℃预变性5 min，95℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。

表1 检测耐药基因引物序列

2.3.3 PCR产物分析 以DL2000 DNA Marker分子量标准做为参考，1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统查看结果并分析。

2.4 抗菌药物敏感性实验 将3株CRAB（2个生物膜阳性，1个阴性）进行药物实验，3株抑膜亚浓度实验菌液转种血平板，使用VITEK2全自动微生物鉴定/药敏仪进行药敏检测。

结 果

1 耐药基因检测 在扩增的18对耐药基因中

floR基因﹑arm基因﹑sul基因三对耐药基因实验结果阳性，见表2，图1-3。

图1 flo基因扩增产物电泳图像

表2 各菌株耐药基因检测情况表

2 药物实验前后的药敏结果

将最小抑膜亚浓度的CRAB进行药敏试验，得到以下结果，见表3。

表3 黄连等五种中药颗粒对CRAB作用前后药敏改变

讨 论

鲍曼不动杆菌，作为重要的医院病原体出现[10]，在生物体或非生物体如导尿管等表面形成生物被膜的能力，使鲍曼不动杆菌能够耐受干燥﹑缺乏营养及消毒灭菌剂等恶劣环境压力，逃避宿主的免疫保护反应，可引起尿路感染，继发性脑膜炎，伤口和烧伤感染以及肺炎[11]。目前，中药对于鲍曼不动杆菌生物膜形成与耐药性之间的关系的报道鲜见，对于分子机制的研究仍存在争议。为进一步明确机制，本实验选取广东省第二中医院CRAB菌株进行用药前后药敏反应检测及耐药基因检测。

图2 arm基因扩增产物电泳图像

图3 sul基因扩增产物电泳图像

实验结果显示，在扩增的18对耐药基因中，原菌液检出floR基因，未检出arm基因﹑sul基因，药物作用后，五味子﹑乌梅﹑连翘实验菌液都检出floR基因﹑arm基因﹑sul基因，黄连﹑黄芩都检出了floR基因及sul基因，部分菌株未检出arm基因。用药前后的药敏实验结果显示：复方新诺明﹑替加环素有不同程度改变，主要为生物膜阳性菌株复方新诺明的药敏浓度增高，生物膜阴性菌株复方新诺明的药敏浓度降低;生物膜阳性菌株替加环素的药敏浓度减低，生物膜阴性菌株替加环素的药敏浓度升高， 耐药基因检测也显示对应磺胺类药物﹑四环素药物耐药机制sul基因和floR基因较原菌的结果有改变。arm基因对细菌的作用是通过甲基化细菌16SrRNA中A位点的特定核苷酸，使氨基糖苷类药物不能与之结合，从而产生耐药，这是一种由质粒介导的耐药机制，而sul的耐药机制是通过提高低亲和力的二氢叶酸合成酶表达，使细菌通过产生这种酶的量增加以获得耐药性，该基因还可随着质粒﹑转座子及整合子/基因盒系统等元件扩散[12]; 药敏结果与基因检测结果一致，说明这五种中药颗粒剂可能对细菌内叶酸合成途径以及细菌蛋白质形成产生影响，导致药敏结果的改变。

李慧玉等人通过研究黄连的有效成分小劈碱对大肠杆菌转录抑制作用的研究发现[13]， 小劈碱通过上游调控元件uPelement的TATA碱基序列抑制sulA﹑recA﹑16S的表达，从而发现TATA序列是小劈碱的作用靶点。司徒瑞儒等[14]人通过研究蛋白质组学研究，发现本研究小檗碱能够上调外膜蛋白Ⅱ﹑AmpC﹑β-内酰胺酶﹑转座酶等蛋白表达，减低硫醇过氧化物酶等蛋白表达，而本研究中五种中药颗粒剂作用相似，可能与作用靶点相近﹑蛋白表达有关。也有文献研究报道[15]，中药抑菌作用的发生，主要通过细胞膜以及细胞壁的破坏起作用，本实验中，用药前后细菌药敏改变不明显，可能与中药抑菌﹑抑制生物膜的机制差异有关。

细菌生物膜是细菌及其分泌物的胞外多聚糖等物质所形成的膜状细菌群体，其生物抗性跟多种因素相关，有研究显示[16]，从细菌附着到非生物表面的机理的原子分辨率见解，研究在体外聚乙烯等模型中，菌毛的表达导致重组菌株亲水性的改变能够有效减少病原体传播，从而达到抑膜的效果。有研究显示[17-20]，高浓度的盐水﹑麦芽糊精﹑聚乙二醇等高渗浓度的低质量渗透性化合物与低质量亲水性抗生素相结合，通过比较未处理和处理过的生物膜中可回收细菌的数量来评估效果，发现能够有效抑制鲍曼不动杆菌生物膜。中药颗粒剂悬液属于高渗浓度化合物范围，其产生抑膜作用可能与上述物质的原理相似。

基于以上结果，下一步我们将用药前菌液细菌基因测序，拟通过检测16S的功能区段，研究用药前后生物膜形成相关基因表达的差异，以进一步探索黄连等五种中药颗粒剂对CRAB的抑膜机制以及产生耐药基因变化原因。另一方面，高渗浓度的低质量渗透性化合物与低质量亲水性抗生素相结合能够更好的产生抑膜效果出发，我们将探讨实验合适中药与抗生素联合抑膜实验的研究。