三种海水生态养殖池塘细菌数量特征及其与环境因子的相关性

何洛迪， 陈 杰， 赵 文， 魏 杰， 马悦欣， 张 湾， 王 宇， 尹东鹏

(大连海洋大学 辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁 大连 116023)

随着生活水平的不断提高和饮食结构的改变，人们对海产品的需求量日渐增加。在市场需求和经济利益的驱动下，水产养殖的规模和产量迅速提高。但传统养殖方式由于存在规范化程度低、养殖模式简单、水资源浪费大、污染严重等问题，因此发展一种高效的优化养殖模式，已经成为水产养殖业发展的必然趋势[1]。海水混合养殖(也称生态养殖)是近年来水产养殖的主要形式，生态养殖是根据不同生物间的共生互补原理，利用自然界物质循环系统形成的一种多元立体综合养殖模式，该模式对于提高饵料利用率，减少环境污染均有积极意义。细菌在养殖生态系统中扮演重要角色，其种类与数量直接影响水质和生物生长繁殖[2]，在物质循环与能量转换中发挥重要作用[3]。一方面可以合成溶解性有机质，另一方面也可将有机化合物转化成各种无机化学成分，是调节水体环境生源要素的重要参与者[4]。此外，某些致病菌在达到适宜生长环境条件时呈爆发性增长可导致养殖生物疾病发生[5-6]。细菌数量常做为判断水体污染程度的指标之一，其变化特征对优化养殖水质，有效改善养殖生态环境和防控生物疾病等方面具有重要意义。国外对单一和混合养殖池塘水体与沉积物中细菌丰度、多样性及其与环境因子之间的相互关系报道较多[7-9]，国内学者曹煜成等[10]研究了虾-鱼-蟹海水养殖池塘细菌数量及其与环境因子的相关性，李秋芬等[11]研究了鱼虾混养生态系统中细菌的动态变化，闫法军等[12]研究了草鱼养殖池溏细菌群落代谢特征与环境因子之间的相互关系，范立民等[13]研究了淡水精养养殖池溏中浮游动植物群落和非生物环境与细菌群落之间的结构关系，但对同一养殖周期多种海水生态养殖池塘中细菌数量及其与环境因子相关性的比较研究未见报道。本研究分析比较了辽宁省锦州市“参-虾”养殖池塘与丹东东港市“蟹-蛏”和“蜇-蛏”养殖池塘中浮游细菌的时空分布特征，通过对细菌数量与环境因子的相关性分析，筛选影响细菌数量的主要环境驱动因子，旨在为黄渤海区海珍品生态高效养殖提供基础数据，为多元立体综合养殖模式中的水质安全与生物疾病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 水样采自辽宁省锦州市达莲公司“刺参(Oplopanaxelatus)-日本对虾(Penaeusjaponicus)”(简称参-虾)养殖池塘，生物养殖周期为6个月(5月至10月)；丹东东港市北井子镇“海蜇(Rhopilemaesculentum)-缢蛏(Sinonovaculaconstricta)-牙鲆(Paralichthysolivaceus)-三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)”(简称蟹-蛏)、“海蜇(Rhopilemaesculentum)-缢蛏(Sinonovaculaconstricta)-牙鲆(Paralichthysolivaceus)-中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)”(简称蜇-蛏)养殖池溏，生物养殖周期为4～5个月(4月至8月)。

1.1.2 主要试剂与仪器设备 无颗粒甲醛固定液(辽宁泉瑞试剂有限公司)，0.1%吖啶橙染液(国药集团化学试剂有限公司)和荧光显微镜镜油(IMMOIL-F30CC，日本奥林巴斯有限公司)。现场环境因子测定设备为便携式多参数水质分析仪(HQ30d，美国Hach公司)；采水装置(自制)为水生80型采水器；抽滤所需设备及用具为循环水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，河南省予华仪器有限公司)；玻璃过滤器(T-50，天津市津腾实验设备有限公司)；微孔滤膜(孔径0.2 μm，直径25 mm，上海兴亚净化材料厂)；计数设备为蔡司荧光显微镜(Zess，HBO50/AC，德国)。

1.2 方法

1.2.1 采样时间及样站设置 2021年5月至10月对锦州市“参-虾”养殖池塘，2021年4月至8月对丹东东港市“蟹-蛏”和“蜇-蛏”养殖池溏分别进行5次采样，样站设置见表1。

表1 三种生态养殖池塘样站设置Table 1 Point setting of three ecological breeding ponds

1.2.2 采样方法 每个池塘采用3点采样法，即在进水口、中间位置及出水口设置采样点，每个采样点分表(水下0.5 m)、中、底(距底0.5 m)三层采水，由于池塘水深变化不大，采用混合采集方式，取混合水样100 mL置于灭菌塑料瓶中加入3%无颗粒甲醛用于细菌计数，同时取2 L水样至采样瓶中用于水质指标测定，水样均置于保温箱中低温储存，并尽快带回室内测定。

1.2.3 细菌计数方法 采用荧光显微镜计数法(AODC)[14]测定细菌数量，取一定体积固定后经无菌水稀释一定倍数的水样，加入0.1倍吖啶橙染液染色，5 min后将过滤后的滤膜置于载玻片上，滴加无荧光润油后盖上盖玻片进行计数。在显微镜100×物镜下，统计随机10个视野下的细菌数量。浮游细菌密度的计算公式如下:

式中:Na为每个视野平均菌数；X为样品稀释倍数；S为滤膜滤水面积(cm2)；St为视野面积(cm2)；V为过滤水的体积(mL)。

1.2.5 数据整理与分析 使用 Excel 2019 对细菌数量和环境因子数据进行计算与绘图，利用 Canoco 5.0 软件进行典范对应分析(CCA)。

2 结果与分析

2.1 实验池塘细菌数量的时空分布

三种生态养殖池塘水体细菌数量时空分布如图1所示。细菌数量时间分布特征表明(图1a)，参-虾池塘细菌密度月均值为1.62×105cell/mL，变化范围为(0.49～3.32)×105cell/mL，7月份最高为2.32×105cell/mL，10月份最低为0.54×105cell/mL，6月、7月和9月细菌密度显著高于5月和10月(P<0.05)；蟹-蛏池塘细菌密度月均值为1.48×105cell/mL，变化范围为(0.52～2.98)×105cell/mL，6月份最高为2.62×105cell/mL，5月份最低为0.61×105cell/mL；蜇-蛏池塘细菌密度月均值为1.52×105cell/mL，变化范围为(0.47～2.55)×105cell/mL，6月份最高为2.41×105cell/mL，5月份最低为0.75×105cell/mL。蟹-蛏池塘6月细菌密度显著高于其他月份(P<0.05)，7月和8月细菌密度显著高于4月和5月(P<0.05)。蜇-蛏池塘6月细菌密度显著高于4月、5月和7月(P<0.05)，7月和8月细菌密度显著高于4月和5月(P<0.05)。除5月参-虾池塘细菌数量显著高于蟹-蛏和蜇-蛏池塘外，其他月份差异均不显著(P>0.05)。

细菌数量空间分布特征表明(图1b)，参-虾池塘细菌密度总体表现为进水口>中间位置>出水口；蟹-蛏池塘为中间位置>进水口>出水口；蜇-蛏池塘为出水口>中间位置>进水口。

图1 三种生态养殖池塘细菌数量时间(a)和空间(b)变化Fig.1 Time (a) and space (b) changes of bacteria in three ecological aquaculture ponds小写字母为同一池塘细菌数量时空比较，大写字母为不同池塘间细菌数量时空比较，不同字母表示组间有显著差异(P<0.05)Lowercase letters refer to the spatial and temporal comparison of the number of bacteria in the same pond, and uppercase letters refer to the spatial and temporal comparison of the number of bacteria in different ponds. Different letters indicate significant difference between groups (P<0.05)

综合三种模式的海水生态养殖池塘，细菌平均密度相差不大，但时间差异明显，夏季(6月、7月、8月)细菌密度高于春季(4月、5月)和秋季(9月、10月)；细菌数量空间分布规律不明显。

2.2 环境因子变化

三种生态养殖池塘的环境因子测定结果见表2。从表2中可见，参-虾池塘透明度、水温、pH、溶解氧、活性磷、总氮和总磷月变化不明显，透明度、水温和pH均值分别为(133.0±24.8) cm、(22.8±5.0) ℃和(8.21±0.20)；溶解氧、活性磷、总氮和总磷均值分别为(7.76±0.70) mg/L、(0.007±0.002) mg/L、(2.23±0.12) mg/L和(0.009±0.001) mg/L，总氮和总磷在5月和6月较高。参-虾池塘化学耗氧量和亚硝态氮月变化较明显，化学耗氧量变化范围在(0.44～2.56) mg/L之间，亚硝态氮在(0.002～0.004) mg/L之间，5月化学耗氧量最高而亚硝态氮最低，9月亚硝态氮最高，7月化学耗氧量最低。参-虾池塘叶绿素a、氨态氮和硝态氮变化显著，叶绿素a 5月最高达3.84 μg/L，随时间逐渐降低，均值为1.46 μg/L；氨态氮随时间先升后降，变化范围(0.020～0.510) mg/L，9月最高；硝态氮随时间逐渐上升，变化范围(0.003～0.032) mg/L，10月达最高。

表2 三种生态养殖池塘环境因子的季节变化Table 2 The seasonal dynamics of environmental factors in three ecological aquaculture ponds

蟹-蛏池塘水温、溶解氧、pH月变化不明显，其均值分别为(24.8±5.6) ℃、(8.47±1.04) mg/L和(8.30±0.12)。透明度、叶绿素a、总氮和总磷月变化较明显，透明度变化范围在(21.7～88.3) cm之间，4月最高，5月最低；叶绿素a变化范围在(0.03～0.07)μg/L之间，随时间逐渐上升；总氮和总磷变化范围分别在(2.28～9.80) mg/L和(0.007～0.045) mg/L。化学耗氧量、活性磷、亚硝态氮、氨态氮和硝态氮变化显著，化学耗氧量在4月高达2.18 mg/L，随时间逐渐降低，均值为(1.21±0.77) mg/L；活性磷变化范围(0.018～0.280) mg/L，均值为(0.107±0.091)mg/L；亚硝态氮和氨态氮变化范围分别为(0.003～0.029) mg/L和(0.010～0.256) mg/L，6月二者均达最高，7月达最低；硝态氮随时间先升后降，变化范围为(0.009～0.063) mg/L，5月最高。

蜇-蛏池塘水温、溶解氧、pH月变化不明显，其均值分别为(23.5±5.4) ℃、(8.00±1.06) mg/L和(8.02±0.12)。透明度、叶绿素a、化学耗氧量、亚硝态氮、氨态氮、总氮和总磷月变化较明显，透明度变化范围(20.0～84.3) cm，4月最高，5月最低；叶绿素a随时间先升后降，变化范围(0.02～0.04) μg/L，6月和7月最高；化学耗氧量变化范围(0.02～1.89) mg/L，随时间先升后降，5月最高；亚硝态氮和氨态氮变化范围分别为(0.001～0.069) mg/L和(0.068～0.615) mg/L，4月二者均达最低，6月亚硝态氮最高，7月氨态氮最高；总氮和总磷的变化范围分别为(2.24～8.18) mg/L和(0.009～0.059) mg/L，4月总氮最高而总磷最低，5月总氮最低，8月总磷最高。活性磷和硝态氮变化显著，变化范围分别为(0.030～0.199)mg/L和(0.023～0.173) mg/L，4月活性磷最高而硝态氮最低，5月活性磷最低而硝态氮最高。

综合三种模式的海水生态养殖池塘，水温、溶解氧和pH变化均不明显，且相差不大；硝态氮均发生显著变化。其中，蜇-蛏和蟹-蛏池塘的硝态氮、亚硝态氮、活性磷、总氮和总磷均高于参-虾池塘，透明度、叶绿素a和化学耗氧量则均低于参-虾池塘。

2.3 细菌数量与环境因子的关系

2.3.1 参-虾池塘细菌数量的驱动因子 参-虾生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析表明(图2)，水温(P=0.001)、化学耗氧量(P=0.001)、氨态氮(P=0.003)、溶解氧(P=0.009)、pH(P=0.013)、亚硝态氮(P=0.034)、叶绿素a(P=0.046)和透明度(P=0.048)是影响细菌数量的主要环境驱动因子(P<0.05)。5月细菌数量与叶绿素a和总磷呈正相关，其中与叶绿素a的相关性较明显；6月与透明度呈正相关；7月与水温呈正相关；而9月与pH、氨态氮和亚硝态氮均呈正相关，其中与氨态氮相关性最明显；10月与总氮呈正相关。

图2 参-虾生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析Fig.2 CCA analysis of bacterial quantity and environmental factors in Oplopanax elatus-Penaeusjaponicus ecological culture pond

2.3.2 蟹-蛏池塘细菌数量的驱动因子 蟹-蛏生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析表明(图3)，水温(P=0.001)、溶解氧(P=0.003)、pH(P=0.004)、活性磷(P=0.006)、总氮(P=0.010)、总磷(P=0.025)、亚硝态氮(P=0.032)和透明度(P=0.043)是影响细菌数量的主要环境驱动因子(P<0.05)。4月细菌数量与活性磷、pH和总氮呈正相关；6月与亚硝态氮呈正相关；7月与水温和总磷呈正相关，其中与水温相关性更明显；而8月与溶解氧和透明度呈正相关，其中与溶解氧相关性最为明显。

图3 蟹-蛏生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析Fig.3 CCA analysis of bacteria quantity and environmental factors in Portunus trituberculatus-Sinonovacula constricta ecological culture pond

2.3.3 蜇-蛏池塘细菌数量的驱动因子 蜇-蛏生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析表明(图4)，水温(P=0.001)、化学耗氧量(P=0.008)、总磷(P=0.011)和叶绿素a(P=0.034)是影响细菌数量的主要环境驱动因子(P<0.05)。6月细菌数量与化学耗氧量呈正相关；7月与叶绿素a和水温呈正相关，其中与水温的相关性更明显；8月细菌数量与总磷呈正相关。

图4 蜇-蛏生态养殖池塘细菌数量与环境因子的 CCA 分析Fig.4 CCA analysis of bacteria quantity and environmental factors in Rhopilema esculentum-Sinonovacula constricta ecological culture pond

综合CCA分析结果显示，不同养殖模式细菌数量的主要环境驱动因子不同，细菌数量均与水温呈显著正相关，蟹-蛏和蜇-蛏池塘细菌数量均与总磷呈显著正相关；细菌数量的驱动因子有明显的时间差异，但规律不明显。

3 讨 论

本研究表明，三种模式海水生态养殖池塘的细菌数量变化范围在104～105cell/mL之间，其中参-虾池塘浮游细菌数量均值较高，蟹-蛏池塘浮游细菌数量均值较低。近年来，不少学者对养殖池溏水体浮游细菌进行了相关调查。杨星星等[16]采用平板菌落计数法检测缢蛏养殖池塘细菌全年变化范围为1.2×103～2.4×105cell/mL，本次调查蟹-蛏、蜇-蛏池塘细菌数量与其较接近。曹煜成等[10]采用平板菌落计数法对虾养殖池塘水体细菌数量计数，其平均值为7.64×104cell/mL；高菲等[17]采用吖啶橙荧光显微镜计数法发现5～7月份刺参养殖池塘细菌数量为(2.14～4.27)×106cell/mL；而本次调查参-虾池塘细菌数量变化范围为(0.49～3.32)×105cell/mL。造成差异的原因，可能是样品会受到采样计数方法、调查时间、养殖种类、养殖模式以及地域环境等综合因素的影响，从而导致不同养殖系统中微生物群落的组成结构各不相同。

细菌受人为因素和环境因子及生物群落等影响，在养殖池塘生态系统中具有重要意义，常被用于反应水体污染情况[18-19]。温度变化会影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌，是微生物生长的重要因素[20-21]。曹煜成等[10]研究表明，细菌数量随水温升高而增加，本研究表明，三种养殖模式池塘细菌数量均与水温呈显著正相关，夏季(6月、7月、8月)的细菌数量高于春季(4月、5月)和秋季(9月、10月)。浮游细菌与浮游植物密切相关，细菌在吸收浮游植物产生的有机质同时，也为浮游植物的生长提供了必要的营养物质和生长环境。在一定程度上，叶绿素a含量代表浮游植物的丰富度[22-24]。有研究报道，细菌丰度与叶绿素之间具有一定的相关性[25-26]，本次调查也表明，参-虾和蜇-蛏池塘细菌数量与叶绿素a含量呈显著正相关。化学耗氧量也是评价水体污染状况的重要指标，本次调查的参-虾和蜇-蛏池塘细菌数量与化学耗氧量呈显著正相关，参-虾池塘可能与浮游植物进行光合作用形成大量有机物质有关，刺参夏眠在一定程度上也会造成有机物的积累，这些为细菌大量繁殖提供了物质基础；蜇-蛏池塘混养生物种类多，分泌代谢产物及人工投喂的巧料等均可为细菌提供丰富的营养物质和适宜的生存环境。氮磷等物质是影响细菌生长繁殖所需的营养成分，同时也是导致水体富营养化的因素[27]。活性磷被认为是水中浮游植物生长所需的重要物质，主要为可溶性磷酸盐。本研究发现，参-虾池塘活性磷含量低于蟹-蛏和蜇-蛏池塘，分析可能由于参虾池塘中活性磷被较多的浮游植物所吸收利用；此外，有研究表明，某些细菌具有使不溶性磷转变为可溶性磷的解磷能力[28]，这可能是蟹-蛏与蜇-蛏池塘中含有较多具有解磷功能的细菌，还需进一步研究证实；本研究表明，蟹-蛏与蜇-蛏池塘细菌数量与总磷呈显著正相关，总磷可能为浮游细菌生长的限制因子。氨态氮是水体中主要氮元素的来源，可促进浮游细菌繁殖生长[29]，养殖过程中会产生大量的亚硝态氮和氨态氮[30-31]，在细菌繁殖速度较慢的情况下，亚硝态氮向硝态氮的转化可能变慢[32]，氮的转化过程复杂，同时与池塘理化因子和生物因子等相互影响，其存在形式在养殖池溏中存在单个因子与细菌数量相关性无法描述的情况。三种模式池塘细菌数量与氮和磷相互关系复杂，相关性上存在较大差异。

微生物与生境之间具有复杂的相互作用：一方面环境因子对微生物的生长和繁殖有影响，另一方面微生物生长繁殖也会影响和改变环境。因此，在池塘养殖过程中，可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面，并利用微生物参与水质调控，为养殖生物提供良好的生存环境，同时防止致病菌的爆发性增长，防控养殖生物疾病发生。