AMPA受体在精神分裂症模型小鼠小胶质细胞和髓鞘发育中的作用*

何子文 张红旗

精神分裂症是一种影响中枢神经系统的脱髓鞘和炎症性疾病，其特征为髓鞘丢失、神经胶质增生和随后的轴突丢失的局灶性病变[1]。先前研究强调了胶质细胞在精神分裂症易感性中的重要作用[2]。在发育过程中，少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)经历了一个复杂的增殖、迁移、分化和髓鞘形成序列[3]。髓鞘再生被认为是通过激活OPCs启动的。最近一项独立的全基因组关联研究已经确定了在小胶质细胞中高度表达的精神分裂症相关基因座，包括谷氨酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor，AMPAR)基因[4]。AMPAR与精神分裂症的病理生理学相关，因为它们在突触事件中发挥核心作用，包括可塑性、神经元成熟、记忆形成和突触发生[5]。在中枢神经系统(CNS)细胞中，AMPAR在小胶质细胞中表达最高[6]。然而，AMPAR在精神分裂症小胶质细胞和髓鞘发育中的作用尚未被探索。因此，本研究参照文献方法在双环己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)诱导的精神分裂症模型小鼠中建立了一条AMPAR条件性敲除线(GluA1-3亚基的敲除)[7]，以此阐明 AMPAR在小胶质细胞和髓鞘发育中的潜在调节作用。其中，CPZ是一种铜螯合剂，可选择性地损伤中枢神经系统中的髓鞘形成细胞少突胶质细胞[8]。因此，CPZ诱导的动物模型已被用于模拟与精神分裂症相关的白质病变和行为[9]。

1 对象与方法

1.1 对象 选取15只AMPAR条件性敲除线(GluA1-3亚基的敲除，KO)和15只野生型(WT)小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，分别纳入KO组和WT组，饲养在无病原体的动物设施中(光/暗循环)置于标准动物室条件下[温度(21±1) ℃；湿度55%～60%；12 h)。为了检查AMPAR在髓鞘再生中的作用，在CPZ模型中将WT与KO小鼠进行了比较。CPZ暴露会导致少突胶质细胞死亡和严重的脱髓鞘，而CPZ撤出会导致自发的髓鞘再生[8]。在本研究中，给小鼠喂食含0.2% CPZ(质量分数百分比，w/w)的混合鼠饲料4周以诱导脱髓鞘(4周时间点)，然后喂食不含CPZ食物3周以使髓鞘再生(4+3周时间点)。

1.2 方法

1.2.1 原代小胶质细胞培养[10]解剖P1-3小鼠的小鼠皮质，并将其放入2 ml的冷Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中。用5 ml血清移液管和玻璃巴斯德移液管研磨破坏组织。破坏的脑组织以300×g的速度离心5 min，然后将颗粒重新悬浮在1 ml的DMEM 中。将细胞悬液通过40 μm细胞过滤器过滤，并在含有10% FBS和1% Pen-Strep的10 ml DMEM中培养。24 h后，用1×PBS洗涤细胞，并用20 ml DMEM/FBS/P/S孵育11～13 d。为了获得小胶质细胞，将烧瓶以125 rpm的速度摇动1～2 h，收集培养基并在涂有FBS的50 ml锥形管中以300 × g离心5 min。然后将小胶质细胞颗粒重新悬浮并以75 000个细胞/孔的密度接种在96孔板上，在含有10% FBS和1% P/S的DMEM中培养。

1.2.2 电子显微镜(Electron Microcopy，EM) 通过用冷PBS灌注固定小鼠，然后在PBS中加入4% PFA。解剖大脑并在4 ℃下将两个中央1 mm矢状切片固定在改良的Karnovski固定剂中至少24 h。用超纯水洗涤后，组织在室温下在1%三氧化锇中固定3 h。将组织在超纯水中洗涤，并在4 ℃下用1% (w/v) 醋酸铀酰染色过夜。然后通过一系列升高的乙醇浓度对样品进行脱水，在环氧丙烷中冲洗两次，并嵌入环氧树脂Eponate-12 (Ted Pella)。使用UMC超薄切片机(德国Leica公司)切割半薄的500 nm切片并转移到碳涂层的组织学载玻片上。然后用4%醋酸双氧铀水溶液和0.1%雷诺柠檬酸铅对切片染色15 min，用超纯水冲洗并在加热板上干燥。使用配备场发射枪的GeminiSEM 300(德国Zeiss公司)进行扫描电子显微镜检查。

1.2.3 免疫组织化学染色、成像和分析 小鼠大脑用20%甘油和2%二甲亚砜处理过夜，以防止出现冷冻伪影。然后将样本嵌入MultiBrain®Technology (美国NeuroScience Associates公司)，用于在明胶基质中进行冠状切片。在甲醛溶液中固化后，将块浸入用碎干冰冷却的2-甲基丁烷中快速冷冻，并安装在AO 860切片机的冷冻台上。MultiBrain®块在切片机上以30 μm的设置进行冠状切片。对于Solochrome染色，每隔12个切片以360 μm的间隔固定在涂有明胶的载玻片上，并按照以下顺序进行风干：95%乙醇，95%乙醇/甲醛；95%乙醇、70%乙醇、dH2O，然后加入到80 ml Solochrome染色溶液(1.5% Solochrome，2.5% v/v硫酸)、320 ml dH2O、100 ml 4%硫酸铁铵，用自来水冲洗，在铁氰化钾-硼酸钠中分化，在自来水中冲洗，用中性红轻轻复染，脱水，在二甲苯中澄清并盖上盖玻片。

对于免疫化学，以360 μm的间隔每隔12个切片进行自由漂浮染色。从一抗开始的所有孵育溶液均使用Tris缓冲盐水(TBS)，以Triton X-100作为载体；所有冲洗均使用TBS。在过氧化氢处理后，切片在室温下与一抗孵育过夜(Iba1∶1∶500，dMBP∶1∶100)。冲洗后，应用生物素化二抗(产生一抗的宿主动物的抗IgG)。进一步冲洗后，使用ABC溶液(抗生物素蛋白-生物素-HRP复合物；美国CA公司)。再次冲洗切片，然后用发色剂：二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和过氧化氢处理以产生可见的反应产物。对于dMBP免疫化学染色切片用浅色硫氨酸Nissl染色剂复染。

在Leica SCN400显微镜(德国Leica公司)对脑组织切片进行成像。使用在高性能计算集群上运行的MATLAB(美国Mathworks公司)以盲法进行图像分析。在每只动物的匹配组织切片水平上手动绘制由胼胝体中的病变区域组成的感兴趣区域(ROI)。使用颜色阈值和形态学操作对dMBP、Iba1和Solochrome阳性染色区域进行分析。从每只动物3个ROI中取平均值。

1.2.4 吞噬作用和迁移测定 对于凋亡小胶质细胞的吞噬作用，将小胶质细胞与1 μM Staurosporine 孵育过夜以诱导细胞凋亡，然后用250 nM Cytotox Red标记，洗涤并加入活的小胶质细胞。2 h后，使用Incucyte S3软件中的自定义分析脚本测量是否存在未清除的Cytotox Red阳性小胶质细胞。

使用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统(美国 Essen Bioscience公司)进行迁移测定。前一天将原代小胶质细胞接种在DMEM/P/S中，并用创口机制造“划痕”。每2 h采集一次孔的图像，持续72 h，并使用相对伤口密度(伤口区域中的细胞密度相对于伤口区域外的细胞密度)来量化迁移。

1.2.5 统计学方法 使用SPSS 21.0处理数据。所有数据均以至少三个独立实验的平均值 ± 标准差的形式呈现。使用Student’st检验(双尾)或单因素方差分析(ANOVA)检验分析实验结果。P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AMPAR在CPZ诱导的精神分裂症髓鞘再生中的作用 CPZ喂食4周后，观察到WT组和KO组小鼠的胼胝体都出现了强烈的脱髓鞘(图1A，中图，深蓝色染色缺失)。然而，在KO组中，整体细胞密度(中性红色斑点)降低(图1A，中图，核染色)。恢复3周后，与WT组相比，KO组的髓鞘再生受损(P<0.001)。为了证实在KO组小鼠中观察到的髓鞘再生受损，通过EM直接评估有髓轴突。在4周时间点，WT组小鼠胼胝体中的有髓轴突几乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢复(图1B)。KO组小鼠在4周时剩余的有髓轴突多于WT组(P<0.01)，表明脱髓鞘过程可能会受到AMPAR缺失的影响。在4 + 3周时，KO组小鼠的有髓轴突比WT组小鼠少(P<0.05)(图1B)，表明AMPAR在CPZ喂食后的髓鞘再生中起重要作用。

2.2 AMPAR在小胶质细胞对脱髓鞘反应中的作用 脱髓鞘后的第一个细胞事件是小胶质细胞激活和浸润到病变中[11]。在基线时，胼胝体中的Iba1(小胶质细胞)染色没有差异。然而，在CPZ喂食4周后，与WT组相比，KO组小鼠的小胶质细胞浸润减少(P<0.0001)。然而，在4+3周时间点，在WT组和KO组小鼠的病变中观察到相似数量的小胶质细胞(图2A)。接下来研究观察了从出生后第1天(P1)-出生后第3天(P3)的WT组和KO组小鼠大脑体外分离的小胶质细胞伤口愈合情况。与WT组小胶质细胞相比，KO组小胶质细胞在伤口闭合方面表现出缺陷(P<0.05)。见图2B。

2.3 AMPAR在小胶质细胞吞噬中的作用 通过对降解的髓鞘碱性蛋白 (dMBP) 进行免疫染色来检查病变中的髓鞘碎片。在4周和4+3周时间点观察到KO较WT中央和外侧胼胝体中有过多的髓鞘碎片(P<0.01)，见图3A。证明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。研究进一步通过使用荧光激活细胞分选(FACS)从脱髓鞘的KO胼胝体中分选Annexin V+和Annexin V-细胞，观察到KO中的Annexin V+细胞比例高于WT(平均为4.38%vs.1.14%)。与Annexin V-细胞相比，Annexin V+细胞表达的小胶质细胞标记基因水平较高，而其他CNS细胞类型表达的基因水平较低(图3B)。这些结果表明，脱髓鞘期间KO胼胝体中的垂死小胶质细胞比WT中更多，这可能是由于KO中凋亡小胶质细胞的清除受损。为了具体评估这一假设，在WT组和KO组小胶质细胞培养物中添加了凋亡小胶质细胞(用Cytotox Red标记)，并观察到KO组小胶质细胞对凋亡细胞的清除较WT组小胶质细胞减少(P<0.01)，见图3C。总之，这些结果表明，AMPAR是脱髓鞘后小胶质细胞吞噬作用所必需的。

注：A、胼胝体的降解MBP (dMBP)染色显示基线时没有dMBP，而在4周和4 + 3周时间点，KO中的dMBP水平升高(比例尺=500 μm)。B、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和OPCs的FACS分选的Annexin V-和Annexin V+细胞的基因组分数。C、通过星形孢菌素培养小胶质细胞以诱导细胞凋亡，用Cytotox Red标记，然后用WT或KO小胶质细胞孵育。2 h后平均荧光强度的变化。NS，不显著；*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.0001

3 讨论

精神分裂症是一种严重而复杂的精神疾病，表现为多种症状和高发病率，对患者和社会产生深远影响[1]。然而，精神分裂症的病因和发病机制尚未完全阐明，并且在揭示精神分裂症的发病机制和发现新疗法方面仍然存在挑战[12]。研究精神分裂症的发病机制和评价药物疗效需要合适的动物模型。CPZ是一种铜螯合剂，可选择性地损伤CNS中的髓鞘形成细胞少突胶质细胞[8]。因此，CPZ诱导的动物模型已被用于模拟与精神分裂症相关的白质病变和行为。本研究采用CPZ喂食4周在小鼠中诱导精神分裂症模型，并发现小鼠胼胝体中的有髓轴突和髓鞘几乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢复，证实了有髓轴突和髓鞘丢失参与精神分裂症的病理过程。

小胶质细胞是髓鞘再生所必需的，因为消融小胶质细胞或阻断小胶质细胞信号传导会导致髓鞘再生受损[13]。此外，与年龄相关的小胶质细胞活动下降会导致髓磷脂清除受损和髓鞘再生缺陷[14]。许多精神分裂症研究都支持谷氨酸假说，并集中在谷氨酸受体AMPAR的失调上，因为它们在突触事件中发挥核心作用，包括可塑性、神经元成熟、记忆形成和突触发生[15]。在这项研究中，通过使用在神经元发育早期消除GluA1、2和3 AMPAR亚基的小鼠系，检查了小胶质细胞中高度表达的AMPAR在髓鞘再生中的作用。结果证明了AMPAR是小胶质细胞对脱髓鞘反应所必需的，这是髓鞘再生过程的关键组成部分。此外，还发现AMPAR敲除小鼠的小胶质细胞在吞噬和迁移方面都存在缺陷，从而导致髓鞘再生受损。

最近已经确定了小胶质细胞在精神分裂症易感性中的作用[6]。本研究结果证明了AMPAR在小鼠脱髓鞘/髓鞘再生过程中小胶质细胞活化中的作用。在培养的人骨髓细胞中，抑制AMPAR会降低髓鞘吞噬作用和抗炎细胞因子IL-10的表达[16]。重要的是，与健康对照组相比，来自精神分裂症患者的MDM吞噬髓鞘和上调IL-10的能力降低，并且表达的AMPAR(RNA和蛋白质)水平降低[17]。髓鞘碎片抑制CNS的恢复，是CNS修复的主要障碍之一[18]。特别是，髓磷脂碎片已被证明可抑制OPC分化和随后的髓鞘再生[19]。然而，所涉及的细胞和分子机制在很大程度上是未知的。本研究在4周和4+3周时间点观察到KO组较WT组小鼠中央和外侧胼胝体中有过多的髓鞘碎片，证明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。此外，还证明了脱髓鞘期间KO组胼胝体中的垂死小胶质细胞比WT组中更多，这可能与小胶质细胞的清除受损有关。

总之，本研究在脱髓鞘和髓鞘再生的CPZ诱导的精神分裂症模型中使用GluA1-3亚基敲除小鼠证实了AMPAR是小胶质细胞对脱髓鞘和随后的髓鞘再生的反应所必需的，并且AMPAR在小胶质细胞吞噬和迁移中具有重要作用。然而，本研究尚不清楚AMPAR通过何种途径介导这些作用，未来有待进一步研究。