HPLC 法同时测定芍药甘草汤中芍药苷和芍药内酯苷的含量

崔 悦， 高 兴， 赵 雪， 冯 波， 关 皎， 朱鹤云

（吉林医药学院药学院，吉林吉林 132013）

芍药甘草汤出自汉代张仲景所著的 《伤寒论》， 由芍药和甘草两味中草药按1：1 配伍组成。 尽管方剂组成简单，但配伍明确，其中，芍药为君药， 甘草为使药， 本方具有良好的止痛药效，可调和肝脾、缓急止痛。 芍药活血、养阴；甘草益气补中，二者相辅相成，临床应用广泛（钱浩良等，2020）。 有文献报道，芍药甘草汤可以治疗胃肠道疾病、皮肤瘙痒、痉挛、减轻颈椎间盘炎症、支气管哮喘等病症（何坚等，2020；何飞等，2020；高志刚等，2019；赵征昊，2018；朱广伟等，2014）。 此外还可联合拉米夫定治疗慢性乙肝（李玢玢等，2020）。 陈剑等（2021）对不同配伍比例的芍药甘草汤治疗脑卒中下肢运动功能障碍的效果进行了研究，结果表明，芍药比例越高，治疗效果越好。 芍药甘草汤的主要活性成分为芍药苷和芍药内酯苷（苟丽琼等，2018），研究表明，芍药苷能够保护心血管、 降低血压 （Louise 等，2018）， 芍药内酯苷能够保护肝脏 （任敏霞等，2020）、抗抑郁（郭超峰等，2019）。传统中草药芍药甘草汤在兽医兽药领域已有应用。 范占炼等（2020）给予瘫痪奶牛芍药甘草汤治疗，奶牛病症得以恢复，起到了很好的效果。本研究以芍药苷和芍药内酯苷为研究对象， 采用高效液相色谱法测定其含量， 以期为芍药甘草汤在兽医兽药领域的质量控制和应用提供一定参考， 为相关药用制剂及饲料的研究开发提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 日本岛津公司LC-20A 型高效液相色谱仪， 上海舜宇恒平科学仪器有限公司FA224型电子天平，上海爱郎仪器有限公司CCA-1112A型旋转蒸发仪， 昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE 型数控超声波清洗器，天津市泰斯特仪器有限公司98-1-C 型数字控温电热套。

1.2 材料 乙腈和甲醇为色谱纯 （美国Fisher Scientific 公司），磷酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），所用水为屈臣氏纯净水，其他试剂均为分析纯。 对照品芍药苷（批号20030901）和芍药内酯苷（批号19121705）购自成都普菲德生物技术有限公司。芍药、炙甘草均购自吉林市吉林大药房，产地分别为安徽、内蒙古。 芍药为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall 的干燥根，炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch 的干燥根和根茎，样本留存于吉林医药学院中药样品室。

1.3 实验方法

1.3.1 混合对照品溶液的配制 取芍药苷、 芍药内酯苷对照品适量置于5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成芍药苷、芍药内酯苷的混合对照品储备液，浓度均为1.0 mg/mL，4 ℃冰箱内保存，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备 按照《伤寒论》中芍药甘草汤处方的配比，称取药材白芍12 g，炙甘草12 g 于1000 mL 圆底烧瓶中，加入屈臣氏纯净水240 mL，浸泡30 min，加热回流提取1 h，提取液用5 层纱布过滤， 残渣再加240 mL 屈臣氏纯净水继续回流1 h，合并两次所得滤液，使用旋转蒸发仪浓缩到50 mL， 置于容量瓶中，4 ℃冷藏，备用。 取上述提取物0.5 mL，置于不同的50 mL 具塞锥形瓶中，取甲醇25 mL 超声30 min，过滤，取续滤液用0.22 μm 微孔滤膜过滤后即得。

1.3.3 色谱条件 采用日本岛津公司Shim-Pack XR-ODS 柱（75 mm×3.0 mm，2.2 μm），预柱为日本岛津公司C18 保护柱（4 mm×3.0 mm，2.2 μm），流动相为0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）（86:14），等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为232 nm，柱温为35 ℃，进样量为20 μL。 芍药苷和芍药内酯苷混合对照品， 芍药甘草汤样品的典型色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）、芍药甘草汤样品（B）的HPLC 色谱图

1.3.4 线性关系 分别精密吸取“1.3.1”项下的芍药苷、芍药内酯苷混合对照品储备液适量，用甲醇稀释配制成芍药苷和芍药内酯苷系列稀释混合对照品溶液，两种成分的质量浓度分别为5、10、20、50、100、200 μg/mL；1.25、2.5、5、12.5、25、50 μg/mL；取上述溶液200 μL，进样分析。 横坐标为对照品质量浓度X（μg/mL），纵坐标为色谱峰面积（Y），线性回归计算。

1.3.5 精密度实验 取上述制备的混合对照品溶液（芍药苷质量浓度为50 μg/mL，芍药内酯苷质量浓度为12.5 μg/mL）200 μL，进样分析。 连续进样6 次，计算峰面积RSD。

1.3.6 稳定性实验 取同一批次的芍药甘草汤200 μL，进样分析。室温下放置0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积RSD。

1.3.7 重复性实验 取同一批芍药甘草汤6 份，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液。 取供试品溶液200 μL 进样分析，记算峰面积RSD、芍药苷和芍药内酯苷的含量。

1.3.8 回收率实验 取已知含量的芍药甘草汤样品各9 份，每份0.25 mL，分别向各样品中加入相当于样品中芍药苷和芍药内酯苷含量80%、100%、120%的对照品溶液各3 份，按“1.3.2”项下方法制得供试品溶液，进样分析，计算芍药苷和芍药内酯苷的回收率和RSD。

1.3.9 样品含量测定 按“1.3.2”项下的方法制备供试品溶液， 进样分析并计算芍药苷和芍药内酯苷的含量。

2 结果与分析

2.1 分析方法验证

2.1.1 线性关系 芍药苷、 芍药内酯苷的线性回归 方 程 分 别 为：Y＝3.347×104X-1.020×105（r＝0.9996）；Y＝2.083×104X-7.717×103（r＝0.9998）。 芍药苷和芍药内酯苷分别在5 ～200 μg/mL；1.25 ～50 μg/mL 内具有良好的线性关系。

2.1.2 精密度实验 芍药苷、芍药内酯苷峰面积的RSD 分别为1.5%、0.38%，说明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性实验 芍药甘草汤中芍药苷和芍药内酯苷峰面积的RSD 分别为2.6%、1.6%，芍药水提物中芍药苷和芍药内酯苷峰面积的RSD 分别为2.3%、2.8%，说明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.1.4 重复性实验 芍药苷和芍药内酯苷在芍药甘草汤中的平均含量分别为3.44、0.829 mg/mL，RSD 分别为2.1%和2.5%； 在芍药水提物中的平均含量分别为3.57 mg/mL 和0.886 mg/mL，RSD分别为2.4%和1.4%，表明方法重复性良好。

2.1.5 回收率实验 两种成分的回收率和RSD结果见表1。

表1 芍药甘草汤样品中芍药苷和芍药内酯苷的回收率

2.2 含量测定 6 批芍药甘草汤样品测定结果见表2。 芍药甘草汤中芍药苷和芍药内酯苷的含量分别为3.16 ～3.46 mg/mL、0.739 ～0.886 mg/mL。

表2 芍药甘草汤样品中芍药苷和芍药内酯苷的含量mg/mL

3 讨论与结论

实验初期以水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈作为流动相考察体系。 采用0.1%磷酸水-乙腈（86：14）作为流动相时分离效果最佳，13 min 即可完成分析且无干扰峰存在。

在全波长扫描的基础上， 对芍药甘草汤中的两种活性成分（芍药苷、芍药内酯苷）进行光谱扫描， 两种成分在232 nm 波长下检测到的色谱峰最强， 基线较为稳定， 获得信息较为全面， 故以232 nm 作为检测波长。

在考察了芍药苷和芍药内酯苷出峰时间和分离效果的基础上， 分别试用了等度和梯度两种洗脱程序。 实验选择的流动相为0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）。 当梯度洗脱时程序设定为：0 ～5 min，10%B→20%B；5 ～10 min，20%B→25%B；10 ～15 min，25%B→35%B；15 ～18 min，35%B→43%B 时，芍药苷、芍药内酯苷分离效果不佳且杂质峰干扰严重；而采用等度洗脱：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）（86:14）时，芍药甘草汤样品中芍药苷和芍药内酯苷的分离效果和出峰时间均较好且杂质峰无干扰，故最终确定使用等度洗脱程序。

本实验对比了超声法和回流法对芍药甘草汤中芍药苷、芍药内酯苷两种活性成分的提取效果，结果表明，超声法提取率较高。 此外，亦对提取溶剂进行了考察。 分别试验了50%、70%、100%乙醇溶液，50%、70%、100%甲醇溶液。最终以综合提取率最高的100%甲醇作为提取溶剂。

本文建立了一种同时测定芍药苷和芍药内酯苷的HPLC 分析方法， 并应用到了芍药甘草汤两种活性成分的含量测定中。该方法具有专属性强、稳定性良好且分析时间短的特点。 本研究可为芍药甘草汤在兽药及饲料领域的应用提供一定基础，有助于芍药甘草汤在饲料行业的开发，并提供一定的质量标准参考。