均匀设计优化Wickerhamomyces anomalus Y-1菌株产酯条件及其产香分析

石 馨，惠 明，田 青，黄继红

河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001

浓香型白酒亦称泸香型，香气主体为己酸乙酯，具有芳香浓郁、香味协调、尾净余长等特点，在我国白酒市场所占份额最大[1-3]。由于环境、气候、原料等原因，导致部分浓香型白酒香气不足、品质较差，有研究将产酯酵母应用于浓香型白酒的酿造，改善酒体品质，并取得了较好的成效[4-5]。产酯酵母[6]是一类能够产生酯类、醇类等多种挥发性香气物质的酵母菌，普遍存在于传统发酵食品中，将产酯酵母应用于白酒发酵可增加香气物质的含量和种类，是改善其风味、提高品质的一种有效方式[7-9]，在白酒酿造行业中应用较为广泛。目前所研究的产酯酵母大多高产乙酸乙酯，而主产己酸乙酯的酵母相对较少，本实验室前期从大曲中分离出1株产酯酵母，经鉴定为异常威客汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，发现其具有较高的产己酸乙酯能力。探究该酵母的发酵产酯特点，对于提高浓香型白酒品质具有重要意义。目前针对该类酵母的产酯发酵调控研究较少[10-11]，因此产酯条件还需调整和优化。作者以异常威客汉姆酵母(命名为WickerhamomycesanomalusY-1)为研究对象，采用均匀设计及主成分分析法优化该菌株的产酯条件，确定最适培养温度、培养时间、转速及接种量，并利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)分析在该条件下的挥发性风味物质，探究其应用潜力，为浓香型白酒的提酯增香提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

WickerhamomycesanomalusY-1，由工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室筛选和保藏。

1.1.2 主要试剂

酵母膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术公司；玉米淀粉：上海麦克林生化科技有限公司；氯化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸正丁酯(2%)：色谱纯，无锡市展望化工试剂公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基

YPD培养基：瑞楚生物有限公司。

产酯培养基：酵母膏10 g/L，玉米淀粉2.9 g/L，蛋白胨20 g/L，(NH4)2SO40.1 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，CaCl20.1 g/L，NH4Cl 0.2 g/L。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津有限公司；TRACE1300气相色谱-质谱联用仪：赛默飞世尔科技公司；固相微萃取装置(SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头)：江苏默克仪器有限公司；ZHJH-C1112C超净工作台、ZQZY-CS全温恒温培养摇床、ZXSD-A1160恒温培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1WickerhamomycesanomalusY-1耐受性研究

考察WickerhamomycesanomalusY-1生长温度耐受性(16、22、28、34、40 ℃)、pH耐受性(3、4、5、6、7、8)、乙醇耐受性(乙醇体积分数0%、2%、4%、6%、8%、10%)。取适量斜面保藏的菌体接种于YPD液体培养基中，120 r/min、28 ℃培养24 h，制备种子液，按5%(V/V)将种子液接种于前期优化的产酯培养基中，分别按照上述不同温度、pH值、乙醇体积分数进行发酵培养，培养结束后测定发酵液在600 nm处的吸光度，并参考文献[12]测定发酵液中总酯含量。

1.3.2 均匀优化试验

在作者前期对该菌株生长特征研究的基础上[13]，以己酸乙酯相对含量为评价指标，温度(X1)、培养时间(X2)、转速(X3)、接种量(X4)为考察因素，进行四因素六水平的均匀优化试验，因素与水平见表1。

表1 均匀优化试验因素与水平Table 1 Uniform optimization test design factors and levels

1.3.3 挥发性物质测定方法

量取5 mL样品于20 mL的顶空瓶中，加入2%乙酸正丁酯内标液5 μL，放入磁力搅拌转子，加盖密封。插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，纤维头置于顶空瓶上部空间，50 ℃水浴平衡10 min，120 r/min萃取50 min，萃取结束后取出手柄，直接进行GC-MS分析。GC-MS设定条件参考文献[14]。

1.3.4 验证试验

对优化后的结果进行验证试验，并与预测结果进行比较，确定该酵母产酯的最适条件。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 26、Origin2018、DPS软件对数据进行二次多项式逐步回归、主成分回归等统计分析。

2 结果与分析

2.1 Wickerhamomyces anomalus Y-1耐受性研究

白酒酿造是一个复杂的生化反应过程，影响微生物生长发育的环境因素有很多，乙醇体积分数、pH值和温度是极其重要的因素。随着发酵的进行，酒醅内部的酸度、温度和乙醇体积分数不断升高，对酵母的生长和发酵均会产生阻碍作用，高温也会导致酶系的钝化直至失活。在发酵后期，酒醅内过高的温度和乙醇体积分数会使发酵停止。因此，对WickerhamomycesanomalusY-1进行耐受性研究，研究不同乙醇体积分数、pH值、温度对菌株生长和产酯能力的影响，结果见图1。

图1 不同乙醇体积分数、pH值和温度对Wickerhamomyces anomalus Y-1生长的影响Fig.1 Effect of different ethanol content,pH value, and temperature on Wickerhamomyces anomalus Y-1 growth

由图1a可知，酵母的D(600)随着乙醇体积分数的增加呈现下降趋势，同时产酯能力也随之下降，可见乙醇对该酵母的生长和产酯均有抑制作用，当乙醇体积分数小于4%时，产酯能力较为稳定，大于4%时，产酯能力明显下降。由图1b可知，随着pH值的升高，该酵母的D(600)和产酯量均呈现先增长后下降的趋势，在pH3和pH8时，生长和产酯能力均较差，在pH5时，产酯量最大。由图1c可知，该酵母随着温度的升高，D(600)和产酯量呈现先增长后下降的趋势，在28 ℃时产酯能力最强，当温度高于28 ℃时，生长能力和产酯能力都急剧下降，在40 ℃时，该酵母几乎不再产酯。

2.2 Wickerhamomyces anomalus Y-1产酯条件优化及回归分析

WickerhamomycesanomalusY-1发酵液中的挥发性物质主要包括酯类、高级醇类、酸类。其中酯类相对含量最高的是己酸乙酯，所以己酸乙酯可视为该酵母的特征产物，质量分数较高的酯类物质依次为辛酸乙酯、庚酸乙酯和十六酸乙酯，故将这4种酯作为该酵母的关键酯类物质。均匀优化试验设计与结果如表2所示，6个试验组中酯类相对含量和关键酯相对含量变化趋势一致，说明这几种酯类物质在整个挥发性组分中占主导地位。

表2 Wickerhamomyces anomalus Y-1均匀试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of ester-producing conditions by Wickerhamomyces anomalus Y-1

产酯酵母代谢复杂，与发酵温度、时间、接种量、转速等多种因素相关。研究发现，高温可以使促进酯类物质产生的酶系钝化失活，从而降低酯类相对含量[15]。培养时间是影响酵母产酯的一个重要因素，随着培养时间的延长，菌体活力逐渐降低，产酯能力随之下降。转速过大或过小都会导致溶氧量发生变化，影响菌体正常生长，从而影响酵母的产酯能力。接种量少会导致单位体积发酵液中所含菌体数过少，影响产酯效果，接种量多则会使有限的营养成分无法供应过多的菌体生长，从而引起产酯能力下降[16]。WickerhamomycesanomalusY-1酵母所产酯类中己酸乙酯相对含量最高，且己酸乙酯为浓香型白酒的主体风味，分析发酵条件对其产己酸乙酯相对含量的影响，对提高浓香型白酒品质有重要意义。因此采用二次多项式逐步回归法对发酵液中酯类相对含量(Y1)、关键酯相对含量(Y2)、己酸乙酯相对含量 (Y3)与温度(X1)、培养时间(X2)、转速(X3)、接种量(X4) 4个因素进行分析，结果如表3所示。酯类相对含量、关键酯相对含量以及己酸乙酯相对含量的回归方程均达到显著水平(P<0.05)，且己酸乙酯相对含量回归方程的R2接近1，说明该回归方程对己酸乙酯相对含量这一观测值拟合度最好，其次是酯类相对含量、关键酯相对含量。

表3 最适条件预测及回归方程Table 3 Optimal condition prediction and regression equation

2.3 发酵液主成分分析

对酯类(Y1)、关键酯(Y2)、己酸乙酯(Y3)、高级醇类(Y4)和酸类(Y5)5个指标的相对含量进行主成分分析，各主成分特征值、贡献率及累计贡献率如表4所示。根据累计贡献率大于85%的原则[17]，提取的3个主成分累计贡献率可达到98.742%，即提取的3个主成分可以解释全部指标的98.742%的信息，能够反映发酵液整体情况。

表4 5个主成分的特征值、贡献率及累计贡献率Table 4 Eigenvalues, contribution rate, and cumulative contribution rate of the 5 principal components

通过主成分分析，得到5个指标的3个主成分特征值的成分矩阵及对应系数，如表5所示。根据成分绝对值大小可以看出，决定第1主成分的指标是酯类相对含量(Y1)、关键酯相对含量(Y2)、己酸乙酯相对含量(Y3)，决定第2主成分的指标是酸类相对含量(Y5)，决定第3主成分的指标是醇类相对含量(Y4)。

表5 5个指标的成分矩阵及对应系数Table 5 Component matrix and corresponding coefficients of 5 indicators

根据特征值对应的系数矩阵，得出主成分表达式(1)、(2)、(3)以及综合得分表达式(4)。

F1=0.527Y1+0.566Y2-0.032Y3-0.199Y4+0.548Y5；

(1)

F2=-0.336Y1+0.133Y2-0.053Y3+0.204Y4+0.908Y5；

(2)

F3=0.252Y1-0.051Y2+0.18Y3+0.944Y4-0.101Y5；

(3)

F=0.593F1+0.216F2+0.190F3。

(4)

通过以上表达式计算主成分F1、F2、F3和综合表达式F，如表6所示，第4组试验综合得分最高，为0.943；第3组试验综合得分最低，为-1.127，与均匀设计试验结果相符，均是第4个试验组发酵液品质最高。

表6 主成分得分Table 6 Principal component score

2.4 最佳培养条件预测及验证

二次多项式逐步回归模型预测表明，当培养温度25.2 ℃、培养时间12.2 h、转速180 r/min、接种量为2.0%(V/V)时，己酸乙酯相对含量预测值为383.720 μg/L。考虑发酵液整体水平，包括酯类相对含量及关键酯相对含量，并结合二者的回归分析以及主成分分析给出的最优因素组合，最终确定最优条件为培养温度25.2 ℃、培养时间12.2 h、转速180 r/min、接种量为9.8%(V/V)。在此条件下进行验证试验，结果显示，发酵液中酯类相对含量、关键酯相对含量、己酸乙酯相对含量分别为680.594、551.201、380.360 μg/L，其中己酸乙酯相对含量接近于预测值，并明显高于试验组中得分最高的第4组中己酸乙酯相对含量，酯类相对含量、关键酯相对含量均高于预测值。说明在该条件下培养，不仅使发酵液中己酸乙酯相对含量明显提升，对发酵液整体水平也有一定改善效果。

2.5 最佳培养条件下的风味物质分析

利用SPME-GC-MS测定最佳培养条件下发酵液中的挥发性物质，总离子流色谱图如图2所示。与NIST质谱数据库进行比对，结合保留时间对样品中挥发性物质进行定性，共鉴定出44种挥发性物质，主要包括酯类、醇类、酸类、醛类等，物质种类及相对含量如表7所示。

图2 挥发性成分GC-MS总离子流图Fig.2 GC-MS total ion chromatography of volatile components

表7 发酵液挥发性物质种类及相对含量Table 7 Types and relative content of volatile substances in fermentation broth

酯类物质对白酒的风格形成具有重要意义，浓香型白酒以己酸乙酯作为主体香，该酯具有浓郁的曲香和菠萝香气，是白酒四大酯类物质之一[18-20]。根据GB/T 10781.1对浓香型白酒的规定，优级浓香型白酒的己酸乙酯含量在1.2～2.8 g/L之间，总酯含量不低于2.5 g/L。综合目前报道的关于产酯酵母的结果来看，大多数产酯酵母通常高产乙酸乙酯，高产己酸乙酯的酵母较少，并且产量较低，该酵母主要产己酸乙酯的这一特性可用于改善浓香型白酒的品质。根据表7可知，酯类物质占总挥发性物质的88.610%，包括己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯等，这些物质都具有独特香气，在浓香型白酒中均有检出[21-22]，对浓香型白酒品质的提升具有一定的意义。

醇类物质在白酒中起助香作用。根据表7可知，发酵液中β-苯乙醇是相对含量最高的醇类物质，占总挥发性物质的6.872%，其次是异戊醇，占总挥发性物质的2.711%。β-苯乙醇是白酒重要的风味成分，适量的添加不仅能赋予白酒一定的玫瑰香气，而且可使其口感更加绵柔，异戊醇则可增加白酒的厚重感[23-24]。除此之外，WickerhamomycesanomalusY-1能产少量的1-丙醇、异丁醇等高级醇，这些醇类在适宜范围内能够增进β-苯乙醇的特殊芳香，并可衬托酯香，使酒香更加饱满。若酒中不含高级醇或含量过低，会使酒味淡薄，随着白酒贮存时间的增加，这些醇类将会作为其他风味物质的前体物质，被缓慢氧化缩合为酯类[25]。

除酯类和醇类外，WickerhamomycesanomalusY-1还能产少量的酸类和醛类。白酒中的酸主要是乙酸、己酸、丁酸等，适量的酸与其他呈味物质一起呈现出白酒特有的芬芳，酸还具有缓冲作用，可消除饮后上头、口味不协调等现象[26-27]。酸含量不足会导致白酒固有风味缺失，含量过高容易出现邪杂味，一般以0.1 g/100 mL为宜。白酒中的醛类对呈香也有一定的作用[28]，比如苯甲醛具有水果香气，壬醛具有玫瑰、柑橘的气味，癸醛具有一定的甜香、蜡香气味，并且醛类物质在白酒的贮存中可以改善酒的嗅香、陈味。由此可见，该酵母不仅具有较强的产酯能力，同时具有突出的产醇、产酸、产醛能力，在白酒酿造工业中具有重要的潜力和价值[29-30]。

3 结论

本研究对先前实验室分离得到的一株产酯酵母WickerhamomycesanomalusY-1进行生长特性研究，并对其产酯条件进行优化，最终确定最适产酯条件为培养温度25.2 ℃，培养时间12.2 h，摇床转速180 r/min，接种量9.8%(V/V)。在此条件下，发酵液中酯类相对含量为680.594 μg/L，己酸乙酯含量为380.360 μg/L，对所产挥发性物质进行分析，发现该酵母不仅有较强的产己酸乙酯能力，还能产辛酸乙酯、庚酸乙酯、β-苯乙醇、癸醛等多种改善白酒风味的物质，对于浓香型白酒的增酯提香具有重要意义。但目前发现的产己酸乙酯的酵母相对较少，产量也较低，继续挖掘高产己酸乙酯菌株并提高产量是改善浓香型白酒品质的一项重要工作。