金种子优质窖泥高产己酸菌的筛选鉴定及其应用性能分析

程 伟，李 娜，张 杰，潘天全，彭 兵，巩子路，吴丽华，吴宏萍

（1.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳 236023；2.安徽金种子集团有限公司检测中心，安徽阜阳 236018）

浓香型白酒在白酒市场上的销售占有率较高， 是最普遍的一种白酒香型，主要分布在四川、苏鲁豫皖等地区，其产量和质量对白酒行业的发展具有重要的影响[1]。浓香型白酒主体香味物质己酸乙酯，是由己酸菌产生的己酸与发酵过程中产生的乙醇发生酯化反应而成，己酸菌作为窖泥中的重要功能微生物，对浓香型白酒风味的形成具有重要作用[2-3]。筛选出优质高产量的己酸菌是众多学者研究的重要方向，高素洁等[4]从富裕酒厂窖泥中分离1 株高产己酸菌株，其己酸含量最高可达540 mg/100 mL；谢圣凯等[5]采用厌氧法从窖泥中筛选出Clostridium guangxiensestrain xsk1 和Clostridium kogasensisstrain xsk2 己酸菌，其己酸产量分别为4.51 g/L、2.5 g/L。窖泥质量的优劣影响着浓香型白酒质量，窖泥质量不仅取决于其理化指标，更取决于窖泥中有益窖泥功能菌的种类、数量及产物的代谢能力，以及营养成分的合理比例，窖泥养护及人工窖泥复配中离不开己酸菌液的应用[6-8]。本研究采用乙酸钠培养基从优质老窖泥中筛选出高产己酸菌，从温度耐受性、乙醇耐受性及己酸菌液的硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、乙醇等添加量对己酸产量的影响等方面研究筛选己酸菌的生理生化特性，并结合16S rDNA 分析及其系统发育学地位，从而为窖池养护及人工窖泥培养提供优质菌株及其培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 样品来源

优质老窖泥：取浓香型酿酒车间13 个大曲酒发酵老窖池的优质窖泥，作为菌种筛选的样品来源，并分别编号为JKY1-JKY13。

1.1.2 培养基

乙酸钠培养基(质量分数%)：乙酸钠0.5%、酵母膏0.1%、硫酸镁0.02%、磷酸氢二钾0.04%、硫酸铵0.05%、碳酸钙1%，乙醇2%（培养基灭菌后再添加），pH6.5，琼脂粉1.5%～2%（液体培养基不添加）。

1.1.3 试剂与仪器

试剂及耗材：乙酸钠、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、琼脂粉、碳酸钙等，生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸铜（分析纯AR），安徽雨轩科技有限公司；己酸（色谱纯）、内标2-乙基丁酸（色谱纯），成都西亚试剂公司；乙醇、乙醚，国药集团化学试剂有限公司；厌氧袋、耗氧剂，日本MGC公司。

仪器设备：LRH-250F 生化培养箱、DHG-9145A 电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Velocity 18R 台式冷冻离心机，澳大利亚Dynamica 公司；Spectramax 384plus 分光光度计，美国MD 公司；2010 型气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器、全自动进样器、自动进样针），日本岛津公司；DB-FFAP 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美国安捷伦公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 己酸菌分离筛选及纯化

将乙酸钠液体培养基装入试管中(装液量90%)，向试管中加入1 g 老窖泥，80 ℃水浴热处理10 min，封口膜密封，37 ℃发酵培养7 d，得到发酵液。用乙醚萃取发酵液，并用硫酸铜显色法[9]初筛，蓝色为阳性；取初筛为阳性的菌液1 mL，添加到装有乙酸钠液体培养基的试管中，80 ℃水浴热处理10 min，密封，37 ℃培养7 d；重复纯化2～3 次，得到纯化后发酵液。将获得的纯化后发酵液进行梯度稀释，并在乙酸钠固体培养基中涂平板，37 ℃培养7 d后，挑取单个菌落进行液体发酵，并通过气相色谱对发酵培养得到的菌液中己酸含量进行检测。

1.2.2 菌体密度检测

在乙酸钠液体培养基中接入5%的己酸菌JZZ种子液，以37 ℃恒温培养3～18 d，每天取培养液液面10 cm 左右菌液样品，采用分光光度计对发酵液菌体密度OD600值进行检测。

1.2.3 己酸的气相检测

将获得的发酵液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，得到过滤液；取过滤液500 μL 于5 mL 容量瓶中，加乙醚定容至5 mL，充分振荡2 min，静置1 min，吸取上层乙醚萃取液，即为己酸，备测。实验设置多次重复，重复实验样品分别编号为1、2、3、4、5、6。通过气相色谱对乙醚萃取液中的己酸含量进行检测。色谱条件为：进样口温度240 ℃；柱箱起始温度：100 ℃(1 min)；升温速率：10 ℃/min；柱温终温度：220 ℃(2 min)；检测器温度250 ℃；气体流量：氢气40 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气30 mL/min；进样方式：分流进样，分流比20∶1；进样体积：1 μL。内标液的配制：准确称取内标物2-乙基丁酸原液0.185 g 于100 mL 容量瓶中，用体积分数为60%乙醇水溶液定容至100 mL，配制1.85 mg/mL 2-乙基丁酸内标液待用。

1.2.4 己酸菌JZZ的温度、乙醇耐受性

将获得的种子液按照5%的接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶(装样量90%)中，制备两组，一组分别在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃的条件下厌氧培养7 d，另一组向三角瓶中添加乙醇，使乙醇在培养基中的体积分数分别为2%、4%、6%、8%和10%，37 ℃厌氧培养7 d 后，两组分别得到发酵液。通过乙醚提取己酸并运用气相色谱法检测各个发酵液中的己酸产量，每个样品3 个重复，观察温度及乙醇含量对产己酸量的影响变化。

1.2.5 培养液配方组分单因素含量影响

以己酸菌JZZ和窖泥混合菌的比例为1∶1配制己酸菌JZZ 和窖泥混合菌复配物，培养温度37 ℃，每3 d 进行取样检测培养液的己酸含量并观察菌体生长情况，取样时每次取3 支2 mL 离心管作为平行，以1 mL 移液器枪头长度为标准每次进行取样。在不改变培养基其他组分的条件下，测定0.005%、0.01%、0.02%、0.04%硫酸镁添加量对己酸含量的影响；在不改变培养基其他组分的条件下，测定0%、0.05%、0.1%、0.15%硫酸铵添加对己酸含量的影响；在不改变培养基其他组分的条件下，测定0%、0.05%、0.1%、0.15%磷酸氢二铵添加量对己酸含量的影响；在不改变培养基其他组分的条件下，测定0%、4%、8%、12%、16%乙醇终浓度添加量对己酸含量的影响。

1.2.6 己酸菌JZZ的形态观察及其16S rDNA鉴定

形态鉴定：单菌落形态观察，经革兰氏染色后镜检[9]。分子鉴定：委托上海美吉生物医药科技有限公司对菌株进行测序，提取菌株基因组，PCR 扩增16S rDNA 片段，扩增程序：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，24个循环，72 ℃、10 min。提交美国国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI），通过基本本地队列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比较分析，用MEGA6 软件构建系统发育树[10]。

2 结果与分析

2.1 高产己酸菌的分离筛选

2.1.1 己酸菌的硫酸铜显色法初筛

己酸菌属于能生成芽孢的梭状芽孢杆菌，其孢子具有耐热性，其营养细胞是不耐热的，可以采用热处理法淘汰较弱的芽孢，同时杀灭营养细胞和其他杂菌，使己酸菌株纯化；因此，将分离培养7 d 后的己酸菌液在85 ℃恒温处理10 min，冷却后再接入新的培养液中培养，以达到纯化己酸菌的目的。分别取JKY1-JKY13第二次己酸菌富集菌液2 mL，加2 mL 2%硫酸铜、1 mL 乙醚，摇匀，静置封层，观察乙醚层显色反应，己酸含量定性检测结果见表1。检测结果初步表明，JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13等的产己酸能力较强。

表1 JKY1-JKY13硫酸铜显色定性检测

2.1.2 己酸菌的单菌挑取及高产菌株筛选

挑 取JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13 稀释涂平板培养皿上，将形态不同的单菌落进行四区划线分离，37 ℃厌氧培养7 d，有菌落出现，通过反复纯化，获取了大量单菌落（图1）。

对分离纯化后的菌种要进行显微镜观察及发酵产物的定量检测，以鉴别己酸菌。通过多次分离、纯化、检测，再选取菌体健壮、活跃、芽孢杆菌占优势、产己酸高的优质菌株。从稀释涂平板培养后的平板中挑取单菌落至液态发酵培养基，37 ℃厌氧培养7 d 后测己酸产量。由表2 可看出，JKY11-E1 的平均己酸产量为3.94 mg/mL，是己酸高产菌株，并将该菌株命名为己酸菌JZZ。

表2 不同编号样品己酸菌产己酸量的检测结果

2.1.3 己酸菌JZZ的己酸产量复测（表3）

如表3 所示，对己酸菌JZZ 的产己酸能力进行了6 次检测，己酸产量测定值分别为：4.33 mg/mL、4.25 mg/mL、4.28 mg/mL、4.55 mg/mL、4.42 mg/mL、4.34 mg/mL，平均值为4.36 mg/mL。这表明己酸菌JZZ菌株不仅产己酸能力较强，而且产量较稳定。

表3 高产己酸菌JZZ的产量稳定性检测结果

2.2 己酸菌JZZ的培养条件分析

2.2.1 己酸菌JZZ与窖泥混合菌的复配培养

己酸检测结果及相关文献对比表明[4-5]，己酸菌JZZ 是高产己酸的菌株。将乙酸钠液体培养基于0.1 MPa 高压灭菌20 min，冷却后加入碳酸钙和乙醇，按照5%的接种量加入己酸菌种子液。对培养的己酸菌液每天观察产气变化，并采用分光光度计对发酵菌液进行检测，通过菌体密度OD600值对己酸菌JZZ 的菌体生长情况分析。结果表明，己酸菌JZZ的生长有明显的规律。

己酸菌培养液可广泛应用于浓香型大曲酒的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，以改善和提高浓香型大曲酒的质量。如图2 所示，己酸菌JZZ 的菌体密度在第9 天时达到峰值，然后呈下降趋势，表明该菌制备窖泥营养液时，较适宜的接种或培养时间在7～9 d。己酸菌是重要的酿酒功能微生物，但单一菌种发挥作用有限，混合菌能提供多种酿酒微生物，协同提高窖泥的酿酒效果。混合菌JKY8 是第二次己酸菌富集菌液，硫酸铜显色定性检测表明，JKY8 具有较高的己酸产量。采用混合菌JKY8 与己酸菌JZZ 复配培养，不同培养时间取样进行GC 检测。如图2 所示，复配混合发酵10 d 后己酸产量增速减慢，当混合菌∶己酸菌为1∶1 时，己酸产量优于其他复配比例组合，且具有产酸协同性，表明在人工窖泥制备时应该采用复合菌接种，有利于保证窖泥质量。

2.2.2 己酸菌JZZ的温度、乙醇耐受性

将己酸菌JZZ 按照5%的接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶（装样量90%）分别在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃厌氧培养7 d 后，运用气相色谱法进行己酸菌己酸产量的测定，每个样品做3 个重复。如图3 所示，37 ℃己酸产量为4.36 mg/mL±0.09 mg/mL，39 ℃、40 ℃时的己酸产量分别是37 ℃的94%、88%，仍然表现出高产特性。在白酒酿造过程中，伴随着粮醅的发酵进程发酵体系内部温度会发生显著变化。投料时初始温度一般为20 ℃左右，随着淀粉降解放热，温度逐步上升至35～40 ℃，之后会维持在这个水平或略有下降；当然，在窖池的不同位置，局部温度也会不同，有的甚至达到40 ℃以上；另外，由于窖池开放式生产，受季节、早晚、阴晴等天气变化，发酵体系温度也将产生变化。这对菌株的温度适应性有较高要求，己酸菌JZZ 在40 ℃时表现出高产特性，能适应酿酒过程中的温度变化。

将己酸菌JZZ 按照5%的接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶（装样量90%），添加乙醇，使乙醇终浓度分别在2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol，厌氧培养7 d 后，运用气相色谱法进行己酸菌己酸产量的测定。如图3 所示，在乙醇浓度2%～6%的范围内表现出高产，可耐受6%vol乙醇浓度，当乙醇浓度为8%vol 时，产量急剧下降。在白酒酿造过程中，伴随着粮醅发酵进程发酵体系内部的乙醇浓度会发生显著变化。发酵初期，随着发酵进行，乙醇浓度逐渐积累，发酵后期达到3%vol～4%vol，局部可能更高。发酵体系乙醇浓度变化，要求窖泥功能菌具有一定程度的乙醇耐受性。目前，尚未有乙醇耐受性的高产己酸菌报道。己酸菌的高己酸产量是浓香型白酒酿造的追求目标，有的己酸菌菌株虽然高产，但对温度变化和乙醇浓度变化适应性不强，导致生产效果不稳定等。己酸菌JZZ 菌株具有适宜温度和乙醇的耐受性，对己酸菌菌株工业生产中的稳定性以及适应传统酿造工艺具有重大意义。

2.2.3 己酸菌液配方组分单因素考察

2.2.3.1 不同硫酸镁、硫酸铵添加量的影响

由图4 可知，在不同硫酸镁浓度添加中，在起始时间内己酸含量几乎相同，之后随着培养时间的延长，己酸含量随着不同硫酸镁浓度的添加呈现先增加后减少的趋势，其中0.01%硫酸镁浓度的添加量均有着较高浓度的己酸含量，表明硫酸镁较适添加量为0.01%。在不同的硫酸铵浓度的添加下，初始时间内不同硫酸铵添加量己酸含量基本相同，随着培养时间延长0%硫酸铵添加始终有较高的己酸含量，而其余组分浓度下的己酸含量相对较低且十分接近，因此可以说明硫酸铵添加量多少对最终己酸含量并无太大影响，而其他组分内pH 值较低而影响己酸的生成。然而考虑最终己酸菌培养液加入到人工窖泥中进行培养，因此考虑最终的硫酸铵添加量为0.05%。

2.2.3.2 不同磷酸氢二钾、乙醇添加量的影响

由图5 可知，磷酸氢二钾浓度越高，己酸含量越大，但在磷酸氢二钾浓度达到0.3%和0.45%时己酸含量已经趋于平稳，因此0.3%磷酸氢二钾添加量为较适添加量。随着培养时间的延长，培养菌液内己酸含量逐渐增大，比较不同乙醇添加量条件下的己酸含量，可以发现，2%vol 乙醇终浓度添加量条件下的己酸含量较大，表明在此培养条件下2%vol的乙醇添加为较适添加量。

根据上述硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、乙醇等因素在己酸菌液配方中的较适添加比例，结合己酸菌培养基组分分析，确定己酸菌JZZ 菌液配方：酵母膏0.1%，醋酸钠0.25%，底锅水10%，硫酸镁0.01%，硫酸铵0.05%，磷酸氢二钾0.3%，乙醇2%vol。

2.3 己酸菌JZZ的形态观察及其16S rDNA鉴定

2.3.1 己酸菌JZZ个体及菌落形态观察

对己酸菌JZZ 进行革兰氏染色观察个体形态。如图6所示，己酸菌JZZ为革兰氏阳性芽孢菌，单细胞为梭形、直杆状，芽孢端生或近端生。在固体培养基培养7 d 后，形成圆形菌落，表面平滑、乳白色，有光泽，边缘整齐，不透明。

2.3.2 己酸菌JZZ的16S rDNA鉴定

提取菌株JZZ 的总DNA 作为模板，采用通用引物27f 和1492r 进行PCR 扩增，得到含有己酸菌JZZ 菌株16S rDNA 保守区的片段并对其进行测序。JZZ 菌株的16S rDNA 序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司完成。将菌株JZZ 的16S rDNA 序列提交美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通过基本本地队列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比较，用MEGA6软件构建系统发育树。

引物序列如下：27f（上游引物）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r（下游引物）：5′-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

表4 JZZ菌株16S rDNA的序列比对结果

研究表明，在细菌分类学16S rDNA的同源性大于97%的为属内同种[11-12]。将菌株JZZ 的16S rDNA 序列在NCBI 中进行同源性比较，同源性较高的为克氏梭状杆菌(Clostridium kluyveri)，同源性大于99%。如表4 与图7 所示，结合菌株JZZ的形态与分子生物学特征，可知己酸菌JZZ 鉴定为克氏梭状杆菌(Clostridium kluyveri)[13]。

3 结论与讨论

在浓香型白酒传统酿造生产中，老窖出好酒，发酵池越老酒质越好，老窖的重要特征在于老熟窖泥。窖泥老熟过程相当缓漫，长达数年甚至更长时间，人工制备窖泥养护液或己酸菌液对窖泥的养护具有重要作用[14]。本研究从优质窖泥中分离筛选高产己酸菌，考察培养温度、乙醇浓度、pH 值等发酵条件对己酸产量的影响，分析己酸菌液配方组分单因素含量的影响等。结果表明，分离筛选得到的高产己酸菌JZZ 为革兰氏阳性杆菌，属克氏梭状杆菌（Clostridium kluyveri），其液态发酵己酸平均产量为4.36 mg/mL，该菌株的温度耐受区间为36～39 ℃，乙醇耐受浓度为2%vol～6%vol，表明该菌株能够较好的适应发酵过程中的温度变化，并具有一定程度的乙醇耐受性。己酸菌JZZ 较适宜的菌液配方组分添加量为硫酸镁0.01%，硫酸铵0.05%，磷酸氢二钾0.3%，食用酒精2%vol，16S rDNA 比对结果表明，JZZ 菌株为克氏梭状杆菌（Clostridium kluyveri）。高产己酸菌的筛选及其生产应用对浓香型白酒的酿造及发酵生香过程具有重要价值，本研究分离筛选的高产己酸菌JZZ 具有优良的生产性能，其优化培养的己酸菌液在人工窖泥培养及窖池养护过程中的实际应用效果，包括对原酒产量和质量的影响、窖泥老化和板结的进程、窖泥功能微生物及其菌群变化等，还有待于进一步的跟踪考察。