不同种类水果酵素发酵特性及抗氧化特性的比较

谢东东，张 楠，孙英淇

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

水果在采摘后仍是一个活的有机体，果实会发生一系列复杂的生理变化，如成熟和衰老[1]。一方面，成熟和衰老的过程中自身营养成分消耗，导致水果的品质不断下降，失去食用价值，尤其对于呼吸跃变型果实来说，呼吸跃变期会使其迅速进入衰老期，同时耐贮性和抗病性也变差; 另一方面，水果在贮藏的过程中，极易受到微生物侵染或因机械损伤等原因而引起腐烂[2]。

酵素，是以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等为原料，经多种有益菌发酵而产生的，含有丰富的维生素、酶、矿物质及次生代谢产物等的功能性微生物发酵保健性食品[3]。天然酵素中的微生物主要有酵母菌、曲霉及乳酸菌[4]，通过发酵，原料中的组织受到微生物的作用而分解，对人体有益的功能性成分得以充分释放出来，且被发酵成小分子营养物质而变得容易被人体吸收，经过微生物发酵转化可进一步增加其功效，降低副作用或产生具有促进肠胃蠕动、降血脂、抗氧化、提高机体免疫功能的生物活性物质[5]。因此采用发酵的方式对采摘后的水果进行加工，制作成酵素，不仅可以提高水果的营养成分，还可以解决不宜储藏的问题，同时延长水果的产业链，增加经济效益。

苹果酵素的研究集中在发酵工艺、抗氧化性能和发酵产物变化等方面[6-9],蓝莓酵素、猕猴桃酵素的研究主要集中在发酵工艺和抗氧化特性[10-16]。水果酵素的发酵是一个动态变化过程，发酵周期的控制需要结合发酵过程中微生物的基质代谢与产物生成情况综合考虑，不同水果酵素的最佳发酵时间也存在差异[17]。研究表明，发酵时间不同会影响酵素产品中活性物质的含量[18]，最终影响酵素的理化特性和抗氧化特性，而理化特性和抗氧化特性是酵素产品质量的关键指标，但目前对其变化规律的研究则相对较少。因此，作者以苹果、蓝莓和猕猴桃3种常见水果为材料，采用酵母发酵的方式，测定发酵3、7、20、40 d时，发酵液中pH值、还原糖含量、乙醇含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和总还原力的变化规律，对比研究这3种水果酵素的发酵特性和抗氧化特性，为水果酵素的生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的苹果、蓝莓、猕猴桃以及红糖、安琪活性干酵母等：市售;酒石酸钾钠、葡萄糖、重铬酸钾、硫酸亚铁、水杨酸、Tris、过硫酸钾、磷酸氢二钠、三氯乙酸、三氯化铁、没食子酸、碳酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸、磷酸二氢钠：洛阳昊华化学试剂有限公司;氢氧化钠(粒)、无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司;考马斯亮蓝G-250、福林酚：上海源叶生物科技有限公司;3,5-二硝基水杨酸：国药集团化学试剂有限公司;苯酚：西陇化工股份有限公司;牛血清白蛋白V：北京索莱宝科技有限公司;DPPH、ABTS：上海麦克林生化科技有限公司;硫酸、盐酸：郑州轩之城化工科技有限公司;邻苯三酚：天津市光复精细化工研究所;甲醇(一级色谱纯)：天津市四友精细化学品有限公司;铁氰化钾:天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HPC-300BSH-Ⅲ恒温恒湿箱、DHG-907电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；TGL-18高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；UV-1800BPC紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；GL2204B电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-3CpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-G6数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

挑选新鲜、无腐烂的苹果、蓝莓、猕猴桃各100 g，用蒸馏水清洗干净后自然晾干，然后将其研磨成糊状，随后转移至离心管中，以4 000 r/min离心20 min，然后取上清液1 mL，转移至50 mL容量瓶中，定容，摇匀，贴好标签，置于冰箱中冷藏，备用。

1.3.2 酵素制备

原料预处理：挑选新鲜、没有腐烂的原料，用蒸馏水清洗干净后自然晾干，削皮(苹果、猕猴桃)，切块，榨汁，放入4 ℃冰箱中冷藏待用[19]。制作发酵液：将红糖、果汁、无菌水按质量比1∶ 3∶ 10混合，搅拌均匀，使红糖全部溶解，得到果汁混合物。酵母活化：取安琪活性干酵母1 g，用10倍蒸馏水溶解，30～35 ℃恒温水浴锅中活化30 min[20]。分装：将500 mL锥形瓶先用自来水洗净，无菌封口膜封口后放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，然后取出，在超净工作台中添加300 mL的果汁混合物，预留出1/3的空间供其发酵。接种：将活化后的酵母接种到盛有果汁混合物的锥形瓶中，用玻璃棒搅拌使其混合均匀。封口：用12 cm×12 cm的无菌容器封口膜(锥形瓶内气体可向外排出，并能阻止瓶外杂菌进入)将锥形瓶密封。发酵：将密封后的锥形瓶放入30 ℃的恒温恒湿发酵箱中发酵，每天进行2次摇瓶，目的是使果汁混合物充分发酵，同时防止表面出现杂菌污染。观察与测量：每天观察锥形瓶中的发酵情况，确保在发酵期间没有其他杂菌污染，直至发酵结束。澄清与离心：分别取发酵3、7、20、40 d的发酵液各10 mL，以4 000 r/min离心20 min，得到上清液。吸取1 mL上清液置于50 mL容量瓶中，定容，摇匀，贴好标签，置于冰箱中冷藏备用。

1.3.3 pH值和还原糖含量的测定

使用pH计测定pH值。采用DNS法测定还原糖含量[21]。

1.3.4 乙醇含量和总酚含量的测定

取样品溶液1.00 mL，加入2.00 mL重铬酸钾溶液，用蒸馏水定容至10 mL，沸水浴10 min后，立即用流水冷却，在波长600 nm处测定吸光度[22]，根据重铬酸钾标准曲线方程计算乙醇含量。采用福林酚法测定不同酵素中的总酚含量[23]。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

按照Mariana等[24]的方法测定DPPH自由基清除率。

1.3.6 羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率的测定

采用分光光度法测定羟基自由基清除率[25]。采用郭雪峰等[26]利用邻苯三酚反应体系自氧化速率的方法测定水果酵素对超氧阴离子自由基的清除率。

1.3.7 ABTS自由基清除率的测定

ABTS工作液的配制：称取3 mg ABTS，溶于0.735 mL蒸馏水中；称取1 mg 过硫酸钾，溶于1.43 mL蒸馏水中。按照Arnao等[27]的方法测定ABTS自由基清除率。

1.3.8 总还原力的测定

利用马士超等[28]的方法测定酵素的总还原力。

1.4 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，采用 SPSS 16.0 进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较的检验方法，采用 Excel 2016作图。

2 结果与分析

2．1 发酵过程中pH值的变化

由图1可知，3种新鲜水果中，苹果的pH值最大，其次是蓝莓，猕猴桃的pH值最小。苹果和猕猴桃的酵素随着发酵时间的延长pH值逐渐增大，在发酵40 d时达到最高；新鲜苹果汁和发酵3 d的苹果酵素的pH值之间没有显著性差异；蓝莓酵素的pH值随着发酵时间的延长先降低后增加，发酵3 d时pH值最小， 40 d时pH值最大。一方面，可能是酵母菌在发酵过程中生物降解了部分有机酸，导致水果中的有机酸含量下降；另一方面，可能是酵母利用还原糖代谢产生的醇类与酸发生了酯化反应，导致pH值呈现上升的趋势。

图1 不同水果酵素的pH值Fig.1 pH values of different fruit enzymes

2．2 发酵过程中还原糖含量的变化

由图2可知，新鲜水果中蓝莓的还原糖含量最高，苹果其次，猕猴桃最低。苹果、蓝莓和猕猴桃酵素随着发酵时间的延长，还原糖的含量显著降低；新鲜猕猴桃和发酵3 d的猕猴桃酵素之间的还原糖含量无显著性差异。发酵3 d的蓝莓酵素的还原糖含量最高，苹果酵素和猕猴桃酵素的还原糖含量没有显著性差异。发酵3 d后各水果酵素的还原糖含量之间没有显著性差异。酵母在发酵过程中消耗还原糖如葡萄糖和果糖，导致其浓度下降，尤其是在酵母的对数生长期，酵母大量增殖，消耗还原糖的速度加快[29]。

图2 不同水果酵素的还原糖含量Fig.2 Reducing sugar content of different fruit enzymes

2．3 发酵过程中乙醇含量的变化

由图3可知，新鲜水果中的乙醇含量显著低于发酵3～40 d酵素中乙醇的含量；苹果酵素、蓝莓酵素和猕猴桃酵素中乙醇含量均随着发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势，苹果酵素和蓝莓酵素在3 d和7 d时的乙醇含量无显著性差异，猕猴桃酵素在发酵3 d时乙醇含量达到最高，而后逐渐降低；发酵7 d时3种水果酵素的乙醇含量之间没有显著性差异；发酵20 d时3种酵素中猕猴桃酵素的乙醇含量最低，苹果酵素和蓝莓酵素的乙醇含量没有显著性差异；发酵40 d时，猕猴桃酵素的乙醇含量在3种水果酵素中最高。在前3 d的发酵过程中糖类逐渐转化为乙醇，乙醇含量升高。但随着发酵时间的延长，乙醇含量逐渐降低并且在40 d时培养基中的乙醇含量显著减少：一方面，可能与30 ℃条件下培养基中乙醇的挥发有关；另一方面，乙醇和酵母代谢产生的酸性物质可能发生了酯化反应，导致了乙醇含量下降。

图3 不同水果酵素的乙醇含量Fig.3 Ethanol content of different fruit enzymes

2．4 发酵过程中总酚含量的变化

由图4可知，3种新鲜水果以及发酵3～40 d时，蓝莓的总酚含量均最高。一方面这可能与蓝莓在试验中未去皮有关[30]，另一方面可能是蓝莓中多酚类物质不断溶出以及一些大分子结合酚类物质被微生物分解为可溶性的小分子酚类化合物[31]。在发酵3～20 d的过程中，3种水果酵素的总酚含量均呈现升降交替的趋势，蓝莓酵素在发酵3 d时总酚含量最高，苹果和猕猴桃酵素在发酵20 d时总酚含量最高，发酵可以显著提高水果中酚类的溶解和利用。

图4 不同水果酵素的总酚含量变化Fig.4 Total phenol content of different fruit enzymes

2．5 发酵过程中DPPH自由基清除率的变化

DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，可以短时间内评价待测样品的抗氧化活性[32]。由图5可知， 与发酵前的新鲜水果汁相比，3种水果汁在发酵后对DPPH自由基的清除率都有所提升，发酵40 d时，3种水果酵素的DPPH自由基清除率均处于自身最高水平。其中，蓝莓酵素对DPPH自由基清除能力最强，在发酵40 d时达到最大清除率，新鲜的蓝莓与发酵3、7、20 d的蓝莓酵素对DPPH自由基清除率的差别不显著。蓝莓具有较好的清除DPPH自由基的能力，且发酵后清除率稍有提升，可能与多酚类物质有关，与Pertuzatti等[33]研究结果一致。

图5 不同水果酵素的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH scavenging rates of different fruit enzymes

2．6 发酵过程中羟自由基清除率的变化

由图6可知，3种新鲜水果的羟自由基清除率均较高，其中，猕猴桃的羟自由基清除率最高，可能与猕猴桃中丰富的维生素C含量有关，但发酵后3种水果酵素的羟自由基清除率都显著降低，但和3、7、20 d时相比，苹果和蓝莓酵素的羟自由基清除率在40 d时显著提高。发酵3 d时，蓝莓酵素对羟自由基的清除率最高；发酵7 d时,猕猴桃酵素对羟自由基的清除率最高；发酵40 d时，苹果酵素对羟自由基的清除率最高。结果表明，发酵对于3种水果的羟自由基清除率的提升不显著，羟自由基清除能力的降低可能是发酵过程中多种有机酸含量降低造成的[34]。

图6 不同水果酵素的羟自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of different fruit enzymes

2．7 发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化

超氧阴离子自由基是活性氧自由基的一种，可以诱导脂类、蛋白质和核酸的氧化损伤。由图7可知，随着发酵时间的延长，3种酵素对超氧阴离子自由基的清除率显著提高，在发酵40 d时分别达到最大值。3种新鲜水果中蓝莓对超氧阴离子自由基的清除率最高；发酵3 d和7 d时3种酵素中苹果酵素对超氧阴离子自由基的清除率最高；发酵20 d时3种水果酵素对超氧阴离子自由基的清除率之间没有显著性差异；发酵40 d时猕猴桃酵素对超氧阴离子自由基的清除率最高。结果表明，3种水果酵素对超氧阴离子自由基的清除能力均显著高于3种新鲜水果。这与发酵后水果酵素中的SOD酶活力的增加有关，SOD酶可以清除体内产生的过量超氧阴离子自由基[35]，说明发酵有利于这3种水果酵素的超氧阴离子自由基清除能力的提高。

图7 不同水果酵素的超氧阴离子自由基清除率Fig.7 Superoxide anion free radical scavenging rates of different fruit enzymes

2．8 发酵过程中ABTS自由基清除率的变化

由图8可知，在3种新鲜水果中，蓝莓对ABTS自由基的清除率最高，苹果的最低。3种水果酵素随发酵时间的延长，对ABTS自由基的清除率都呈现出先升高后降低的趋势，且都在发酵3 d时对ABTS自由基的清除率达到最大值。与新鲜水果相比，发酵3、7、20 d都可以显著提高ABTS自由基清除率，且发酵3 d时，效果最好。酚类物质与ABTS自由基的清除能力具有显著的正相关性[36]，本研究中ABTS自由基清除率与总酚含量也呈正相关。

图8 不同水果酵素的ABTS自由基清除率Fig.8 ABTS scavenging rates of different fruit enzymes

2．9 发酵过程中总还原力的变化

总还原力与吸光度成正比，吸光度越大，总还原力就越强，抗氧化效果也越好。由图9可知，苹果酵素的总还原力在发酵3 d时最强，从7 d开始保持稳定；蓝莓酵素随发酵时间的延长，总还原力先增强后趋于稳定，发酵7 d时总还原力达到最强；猕猴桃酵素在发酵20 d时总还原力达到最强。3种新鲜水果中蓝莓的总还原力最强，苹果与猕猴桃之间没有显著差异；发酵3～40 d时蓝莓酵素的总还原力最强, 发酵3 d时猕猴桃酵素的总还原力最弱，发酵20 d时苹果酵素的总还原力最弱;发酵可以显著提高3种水果的的总还原力。

图9 不同水果酵素的总还原力Fig.9 Total reducing power of different fruit enzymes

3 结论

与新鲜水果对比，发酵之后，苹果、蓝莓和猕猴桃酵素的pH值显著提高，还原糖含量显著下降，乙醇含量呈现先升高再下降的趋势，总酚含量呈现升降交替趋势。发酵降低了酵素的羟自由基清除率，DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力在40 d时达到最大值，ABTS自由基清除能力在3 d时达到最大值，最终提高了苹果、蓝莓和猕猴桃的总还原力，苹果酵素总还原力最强的发酵时间为3 d，蓝莓酵素为7 d，猕猴桃酵素为20 d，本试验初步探究了不同种类水果酵素发酵特性及抗氧化特性，下一步还需要结合感官品质和卫生指标进行深入研究。