红肉和白肉苹果非浓缩还原汁制汁残余果渣发酵产物的分析

王彦博，陈雨，高强，张玉刚，孙晓红,

(1.青岛农业大学园艺学院/青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室,山东青岛 266109;2.青岛农业大学生命科学学院)

苹果(Malus×domesticaBorkh)是蔷薇科苹果属植物。我国是世界苹果第一生产大国，其栽培面积和产量在世界上名列前茅，其中用于加工部分的苹果占10%～20%[1]，苹果加工产品主要包括浓缩汁、鲜榨汁、苹果酒[2-3]、苹果醋[4]、苹果脆片[5]等。相比于鲜食苹果，苹果加工产品尤其是苹果果汁产品，因其健康营养、方便快捷，受到越来越多消费者的青睐。目前市面上的果汁主要分为浓缩还原(from concentrate，FC)果汁和非浓缩还原(not from concentrate，NFC)果汁，NFC果汁由水果直接压榨消毒杀菌后灌装[6]，更多保留了水果本身的口味和营养成分，深受年轻消费群体喜爱。但苹果制汁后的副产品——苹果果渣，由于其附加值低，经常被废弃，既污染环境又浪费资源。

水果发酵是以水果为原材料，在多种有益微生物的作用下完成。发酵产物既保留了水果本身的营养物质和活性成分，又因为经过微生物的发酵作用而富含酶和多种次生代谢产物，具有较好的抗氧化功能[7]，有益于身体健康[8]。果蔬发酵产品在日韩和东南亚地区较为流行，近年来进入我国市场也广受欢迎。姜峰等[9]以青梅为材料进行发酵，测得发酵产物有着良好的抗氧化能力；王虹玲等[10]以软枣猕猴桃、寒富苹果和百香果为原料进行发酵，发现发酵产物的抗氧化能力和清除自由基能力显著；邵颖等[11]以48种水果蔬菜发酵制作发酵产物，发现其中多种酶尤其是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性都有所提高；刘晓燕等[12]使用刺梨果渣发酵，发现发酵液中各种有机酸的含量都有所提高。但是以苹果果渣、尤其是红肉苹果果渣为原料进行发酵的研究鲜有报道。

本研究利用NFC制汁残余果渣生产发酵产物，测定红肉苹果果渣和白肉苹果果渣在7个发酵时间的营养成分和抗氧化能力，以期为苹果果渣发酵产品的开发利用和提高NFC果汁的附加值提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

红肉苹果(‘2011-W21-2Z-N7-W’和‘2011-W25-1Z-N4-N’)和白肉苹果(‘福丽’和‘富士’)加工NFC果汁剩余的果渣，红糖(青州市康嘉食品有限公司)，双歧杆菌酸奶发酵粉(北京川秀科技有限公司)。

1.1.2 试验药品

超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒购自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；考马斯亮蓝试剂为实验室配制；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)购自梯希爱(上海)化成工业有限公司；硫酸亚铁购自中国天津市巴斯夫化工有限公司；水杨酸购自国药集团化学有限公司；乙醇与甲醇购自天津市富宇精细化工有限公司；磷酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；双蒸水为实验室自制。

1.1.3 试验仪器

酶标仪(Bio Tek Cytation1)，高效液相色谱HPLC(Agilent1260)，自动高压蒸汽灭菌锅(GI80TW)，离心机(TGL-16G)，超声波清洗机(KQ3200E)，超净工作台(SW-CJ-1FD)，水浴锅，移液枪，天平等。

1.2 试验方法

1.2.1 果渣发酵

(1) 发酵所用锥形瓶、蒸馏水、镊子等用高压蒸汽灭菌器灭菌，移液枪和天平用75%乙醇擦拭，红糖、果渣在超净工作台上平铺，紫外杀菌0.5 h，后期所有操作均在超净工作台中进行。

(2) 双歧杆菌发酵粉1 g溶于50 mL蒸馏水制成发酵菌液。

(3) 每份称量20 g果渣、15 g红糖、40 mL蒸馏水，放入锥形瓶，超声处理30 min，向发酵瓶中加入1 mL菌液，密封。

(4) 将锥形瓶摆放于培养箱，25 ℃避光发酵0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d和60 d，共7个处理，分别记为1、2、3、4、5、6、7。

1.2.2 发酵液制备

(1) 将发酵完毕的锥形瓶置于超声仪中在4 ℃以下超声处理30 min，充分释放发酵产物。

(2) 发酵内容物分装在50 mL离心管中，4 ℃，5 000 r/min离心30 min。

(3) 离心上清液即为待测样品，分装在2 mL的离心管中，标注日期和处理批次，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 pH测定

用pH仪测定样品的pH。

1.2.4 有机酸测定

1.2.4.1 苹果酸测定

按照一定浓度梯度，配制苹果酸标准样液，用一次性针管过滤器抽滤，备用。有机相(甲醇)和水相(千分之一磷酸)用抽滤漏斗抽滤后放入超声破碎仪中超声振出气泡。用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析标准样品，制备标准曲线。待测样品用一次性针管过滤器抽滤，用HPLC分析样品苹果酸含量。

1.2.4.2 草酸测定

按照一定浓度梯度，配制草酸标准样品，用一次性针管过滤器抽滤，备用。草酸测定方法同苹果酸。

1.2.5 总蛋白质含量测定

用考马斯亮蓝G-250法测定样品总蛋白质含量[13]，用1 mg/mL的牛血清白蛋白制备标准曲线，利用标准曲线的线性方程来计算样品蛋白质含量。

1.2.6 抗氧化能力测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率测定

利用DPPH检测法检测样品中DPPH自由基清除能力，方法如下：在66 μL的样品溶液中加入浓度为0.2 mmol/L的DPPH自由基醇溶液(0.078 8 g 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基溶于1 L乙醇中)132 μL。充分混匀后立即使用酶标仪在515 nm处测量吸光度记为A0，避光反应30 min后用酶标仪在515 nm处测量吸光度记为A30。用纯乙醇做空白。

计算公式：

DPPH清除率(%)=(A0-A30)/A0×100%

A0为反应开始时的吸光度；A30为反应30 min后的吸光度。

1.2.6.2 HO·清除率测定

在96孔板中加入50 μL样品，50 μL浓度为9 mmol/L的硫酸亚铁溶液(1.368 g/L，即用136.8 mg硫酸亚铁溶于100 mL蒸馏水中)，50 μL浓度为9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液(1.243 g/L，即用124.3 mg水杨酸溶于100 mL无水乙醇中)，最后加入50 μL浓度为8.8 mmol/L的H2O2启动反应。本底测定用50 μL蒸馏水代替H2O2，其余试剂与样品测定相同。200 μL蒸馏水滴入96孔板做空白对照，37 ℃水浴反应30 min后测定510 nm下样品的吸光度值。

公式如下：

HO·清除率(%)=[Ao-(Ax-Axo)/Ao]×100%

Ao为空白对照吸光度；Ax为样品吸光度；Axo为本底吸光度。

1.2.7 SOD活性检测

SOD活性检测参照超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司)说明书操作。

X为抑制百分率(%)；A01为空白组1的吸光度；A02为空白组2的吸光度；AX为样品组吸光度；F为样本稀释倍数。

1.2.8 数据处理

红肉果渣和白肉果渣各设置7个发酵时间分组处理，每组3个重复；每个样品测定3次，技术重复结果取平均值。利用Excel软件和GraphPad Prism软件对试验数据进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵产物的pH与有机酸分析

发酵过程中有机酸的含量影响pH的大小，反映了发酵的进程。红肉和白肉苹果果渣不同发酵时间的苹果酸和草酸的标准曲线及含量见图1、图2。从图1和图2中我们可以看出，发酵过程开始时(处理1)，由于红肉果渣含有更多的苹果酸和草酸，其含量分别达到1.860 mg/mL和0.170 mg/mL；而白肉果渣苹果酸和草酸的含量只有0.590 mg/mL和0.046 mg/mL。红肉和白肉苹果果渣不同发酵时间的pH见图3。结合图1、图2发现，处理1(0 d)红肉果渣和白肉果渣pH相差很大，是由红肉果渣和白肉果渣中苹果酸和草酸含量差距造成。随着发酵的进行，红肉果渣的苹果酸在处理3(20 d)时出现了短暂的下降之后又出现了回升，并且30 d时基本稳定在2.600 mg/mL，后续发酵过程变化不大；而白肉果渣的苹果酸含量先上升，30 d时达到顶峰，含量为1.670 mg/mL，随后下降。红肉果渣和白肉果渣的草酸含量随着发酵的进行，都呈现出逐渐上升的趋势。

图1 苹果酸标准曲线(A)及红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物苹果酸含量(B)Fig. 1 Standard curves of malic acid (A) and malic acid content of red-fleshed apple andwhite-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：横坐标1、2、3、4、5、6、7分别表示处理0 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d和60 d，下同；“**”表示P<0.05。

图2 草酸标准曲线(A)及红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物的草酸含量(B)Fig. 2 Standard curves of oxalic acid (A) and oxalic acid content of red-fleshed apple andwhite-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：ns表示无显著差异P>0.1。

图3 红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物的pHFig. 3 pH values of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注： ns表示无显著差异P>0.1；“**”表示P<0.05。

在发酵过程中，红肉果渣苹果酸的含量始终高于白肉果渣。发酵20 d、30 d和50 d时红肉果渣草酸的含量低于白肉果渣。因为在发酵果渣中苹果酸的含量远高于草酸的含量，所以总体比较红肉果渣的有机酸含量高于白肉果渣，表现为红肉果渣的pH基本低于白肉果渣的pH。

2.2 发酵产物的蛋白质含量分析

红肉和白肉苹果果渣在不同发酵时间的蛋白质含量见图4。通过比较发现，不论红肉果渣还是白肉果渣，发酵过程中其蛋白质的含量均有所下降，没有显著变化。相同处理组红肉果渣的蛋白质含量始终高于白肉果渣，两者差异显著。

图4 蛋白质标准曲线(A)及红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物蛋白质含量(B)Fig. 4 Standard curves of protein (A) and protein content of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time (B)注：显著性差异“***”表示P<0.01。

2.3 发酵产物的抗氧化能力分析

DPPH是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色。当加入自由基清除剂后其颜色变浅，吸光度变小，且与自由基清除率呈线性关系，因此被广泛应用于抗氧化能力的测定。羟基自由基对自由基反应较强，也常用于抗氧化能力的测定。

红肉和白肉苹果果渣不同发酵时间发酵产物抗氧化能力测定见图5、图6。从图5看出红肉果渣发酵产物DPPH清除率在处理4(30 d)显著高于处理1、2、3，达到58.41%，之后略微提高。白肉果渣发酵产物DPPH清除率，处理1、2、3均高于同处理的红肉果渣，处理4(30 d)清除率升高到56.32%，低于同处理的红肉果渣。红肉和白肉苹果果渣的DPPH清除率均在30 d达到较高水平，红肉果渣清除率略高于白肉果渣，但差异不显著。

图5 红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物DPPH清除能力测定Fig. 5 Determination of DPPH scavenging ability of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示无显著差异 P>0.1。

从图6可以看出整个发酵过程中红肉果渣发酵产物的羟基自由基清除率始终高于白肉果渣。红肉果渣羟基自由基清除率在35.25%上下浮动，不同处理差异不显著(P>0.1)。而白肉果渣的羟基自由基清除率，随着发酵的进行呈现持续下降的趋势，并且从处理5(40 d)后大幅降低，显著低于红肉果渣。

图6 红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物羟基自由基清除能力测定Fig. 6 Determination of hydroxyl radical scavenging ability of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示无显著差异P>0.1；“**”表示P<0.05。

综合分析，红肉果渣发酵产物羟基自由基清除能力高于白肉果渣，而DPPH清除能力与白肉果渣无显著差异。

2.4 发酵产物的SOD活力分析

红肉和白肉苹果果渣不同发酵时间的SOD活力测定结果见图7。图中可以看出红肉果渣发酵产物SOD活力呈现先升高后下降趋势，在处理5(40 d)酶活力最高，达到了132.66 U/g。白肉果渣发酵在处理6(50 d)时SOD活力达到最高值，为150.58 U/g。综合比较红肉果渣和白肉果渣发酵产物的SOD活力，在处理4、5时期红肉果渣SOD活力显著高于白肉果渣(P>0.1)，处理6时期白肉果渣SOD活力显著高于红肉果渣(P>0.1)，其他处理两者无显著差异。

图7 红肉和白肉苹果果渣不同处理发酵产物的SOD活力比较Fig. 7 Comparison of SOD activity of red-fleshed apple and white-fleshed apple pomace at different fermentation time注：ns表示无显著差异P>0.1；“*”表示P<0.1。

3 讨论

本研究使用NFC制汁残余的红肉和白肉苹果果渣进行发酵，检测了7个发酵处理发酵产物的pH、特征有机酸和蛋白质含量、抗氧化能力及SOD酶活力，比较红肉果渣发酵产物与白肉果渣发酵产物的差异。

发酵过程中，特征有机酸表示微生物代谢的情况，而pH的变化表示发酵的进程并与特征有机酸相关。苹果果渣中主要的特征有机酸为苹果酸和草酸。我们比较红肉、白肉果渣的pH和特征有机酸，发现30 d左右发酵基本进入了稳定状态，后续发酵产物的酸度并没有明显的变化，红肉果渣发酵产物在酸度上高于白肉果渣。陈小伟等[14]使用草莓进行发酵时还测量了发酵产物的总酸和总糖，更能反映发酵进程的变化。

蛋白质是发酵产物中重要的营养成分[15-16]。比较红肉与白肉果渣发酵过程中的蛋白质含量，发现红肉果渣发酵产物的蛋白质明显高于白肉果渣。并且整个发酵过程中蛋白质的含量变化不显著，保持相对稳定。今后在蛋白质营养方面会加强相关酶和氨基酸的研究，更进一步探究其营养成分的变化。

当前很多疾病都是自由基过氧化导致的，发酵产物作为一种生物大分子，能参与人体代谢[17]，减缓自由基氧化[18-20]。近年来发酵产物的研发备受关注，本研究通过对DPPH清除率和羟基自由基清除率的测定，发现红肉和白肉果渣发酵产物的DPPH清除率均提高，但二者差异不显著，红肉果渣发酵产物羟基自由基清除率优于白肉果渣。超氧化物歧化酶是一种含有金属元素的活性蛋白酶，它广泛存在于生物体中[21]并对有机体氧化和抗氧化的平衡起着至关重要的作用[22-23]，超氧化物歧化酶协同过氧化氢酶和过氧化物酶能够把有害的超氧自由基降解。本研究发现果渣发酵提高了SOD活力，红肉果渣在发酵40 d SOD活力最高，且显著高于白肉果渣，而白肉果渣发酵产物SOD活力在50 d后达到最高值。

综上所述，NFC制汁残余果渣是优质发酵原料，红肉苹果果渣发酵产物在有机酸、蛋白质、羟基自由基清除率方面优于白肉果渣发酵产物，在SOD活力和DPPH清除率方面与白肉果渣发酵产物无明显差异。综合测评，红肉苹果果渣发酵40 d以上效果最佳。