咪唑乙烟酸降解菌分离鉴定、降解条件优化及去毒效应研究

苗静波，王燕如，杨勇，张清明

(青岛农业大学植物医学学院/山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛266109)

收稿日期：2021-08-31

基金项目：山东省自然科学基金(ZR2016CM11)；山东省重点研发计划(2017GSF21112)

作者简介：苗静波(1995—)，男，河北张家口人，在读硕士，主要从事农药环境毒理与污染修复。E-mail：1365952338@qq.com

通信作者：张清明(1978—)，男，山东博兴人，教授，博士，主要从事农药环境毒理与污染修复研究。E-mail：qmzhang@qau.edu.cn

咪唑乙烟酸是由美国氰胺公司开发的咪唑啉酮类除草剂中的一种，通过抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)或乙酸羟酸合成酶(AHAs)的活性，阻碍氨基酸合成使植物停止生长而死亡[1]。咪唑乙烟酸主要用于防治一年生和多年生禾本科与阔叶杂草，因其在大豆体内能快速分解，故被广泛应用于大豆田除草[2]，是咪唑啉酮类除草剂在我国销售的主要商品。但是咪唑乙烟酸在土壤中残效期长，长期大面积使用不仅会对油菜、水稻、玉米等后茬敏感作物产生药害，造成减产、甚至绝产的严重后果[3]，还会影响轮作的正常进行，使大豆产量与质量显著下降[4]；土壤中残留的咪唑乙烟酸还会通过淋溶或挥发作用对大气和地下水造成污染[5-7]。除此之外，咪唑乙烟酸的大量使用，还有可能减少生物多样性、降低土壤质量、减少生物固氮等[8]。所以，如何快速、有效、环保的修复咪唑乙烟酸残留污染成为亟待解决地问题。

目前，对咪唑乙烟酸残留污染的治理方法主要有生物降解和非生物降解[9]，但传统治理方法往往存在治理周期长、清除速度慢、易造成二次污染等问题，不适宜在大豆田中大面积应用。Jerry等[10]利用14C标记法研究证明，土壤中的咪唑乙烟酸主要通过微生物降解，而且微生物降解除草剂对环境污染小，安全性较高，所以分离筛选出能高效降解咪唑乙烟酸的微生物是解决其污染问题的有效途径[11]。目前已经有丙酸杆菌属(Propionibacterium)、海球菌属(Marinococcus)、节细菌属(Arthrobacter)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、无色杆菌属(Photorhabdus)等细菌被发现对咪唑乙烟酸有降解作用[12]。

为了进一步丰富咪唑乙烟酸降解菌菌库，优化菌株降解条件，本研究利用高压富集驯化的方法从山东农田土壤中分离筛选出1株可降解咪唑乙烟酸的细菌(MZ-1)，并对其分类地位和降解特性进行了研究。同时，采用响应面分析法优化其对咪唑乙烟酸的降解条件以提高降解效率，并且利用油菜种子作为生物材料，通过比较降解前后的含咪唑乙烟酸培养液对油菜种子的毒性差别，来验证菌株对咪唑乙烟酸的去毒效果，以期为咪唑乙烟酸残留污染的生物修复提供材料和方法基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂及仪器

咪唑乙烟酸原药(98%)，由山东先达农化股份有限公司提供。甲醇和乙腈均为色谱级，试验中所需的其他试剂均为分析纯。

超高效液相色谱质谱联用仪(Vanquish 超高效液相色谱仪和LTQ XL质谱仪，赛默飞世尔科技公司，美国)；恒温振荡器(THZ-98AB，上海-恒科)；CP214电子天平(奥豪斯仪器公司，上海)；SevenCompact型pH计(梅特勒-托利多仪器公司，瑞士)；UV-2600型紫外可见分光光度计(岛津仪器公司，日本)。

1.1.2 培养基

富集培养基：5 g蛋白胨，5 g酵母粉，1 g K2HPO4，1 g葡萄糖，1 000 mL蒸馏水。

选择培养基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.1 g 蛋白胨，蒸馏水 1 000 mL。

基础盐培养基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，0.1 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸馏水。

LB培养基：5 g酵母膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，1 000 mL蒸馏水。

所有培养基pH调节至7.0，固体培养基添加2.0%的琼脂粉，并在高压灭菌锅中121 ℃灭菌25 min。

1.2 降解菌的富集驯化、分离及纯化

试验土壤采集于山东某长期施用咪唑乙烟酸的农田中，采用逐级加量驯化的方法进行高效降解菌的驯化筛选[13]。取5 g土壤加入50 mL LB培养基中，30 ℃，160 r/min培养24 h，取上述培养液10 mL加入100 mL的选择培养基中(咪唑乙烟酸初始浓度为100 mg/L)培养，5 d后转接至咪唑乙烟酸浓度更高的选择培养基中(浓度每次提高100 mg/L)，逐级提高培养基中咪唑乙烟酸的浓度，直至达到500 mg/L。吸取50 μL上述培养液涂布于咪唑乙烟酸浓度为500 mg/L的固体选择培养基上，30 ℃培养，待平板上出现肉眼可见的菌落，挑取菌落进一步分离纯化，共分离得到4株形态差异的菌株。采用高效液相色谱法确定纯化后的菌株对咪唑乙烟酸的降解能力，选取降解能力最强的降解菌(命名为MZ-1)进行后续的研究，并且采用甘油管冷冻保存法于-20 ℃下保存。

1.3 降解菌MZ-1的鉴定

参照赵婷等[14]的方法，通过形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析对降解菌MZ-1进行鉴定。16S rRNA扩增序列引物为细菌通用引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。将PCR产物送至上海生工公司进行测序，用RNAman拼接，将拼接结果与Genbank上已公布的基因序列进行比较，采用MEGA 7软件进行系统发育树的构建。所得序列上传至Genbank获得序列号为MW541635。

1.4 咪唑乙烟酸降解菌降解率测定

1.4.1 咪唑乙烟酸的提取

参照杨鑫[15]的方法进行，取待测培养液5 mL于50 mL离心管中，按培养液与二氯甲烷体积比为1∶4的比例加入二氯甲烷。充分震荡后，静置5 min，用移液枪弃去上层水层，将有机相倒入50 mL圆底烧瓶，在旋转蒸发仪上40 ℃蒸发近干，用5 mL色谱纯甲醇反复润洗，用1 mL一次性注射器吸取，过0.22 μm滤膜，加入自动进样小瓶待测。

1.4.2 超高效液相色谱检测条件

参照贾福艳等[16]的方法进行，液相色谱柱：Thermo Hypersll GOLD C18 (3 μm, 2.1 × 100 mm)；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相：乙腈与1%冰乙酸体积比为80∶20溶液；检测波长：254 nm。此条件下，咪唑乙烟酸的保留时间为1.17 min。

1.4.3 降解菌MZ-1降解性能的测定

将平板上的菌落接种于50 mL LB液体培养基中，30 ℃，160 r/min培养12 h后，利用紫外分光光度计测定菌悬液在600 nm处的吸光度(OD600)，用灭菌的新鲜培养液将OD600调节至1.0，制成母液，按照5 %接菌量，接种至50 mL基础无机盐培养液中，其中咪唑乙烟酸初始浓度为200 mg/L，培养温度 30 ℃，160 r/min，黑暗培养5 d。按照1.4.1方法提取咪唑乙烟酸，按照1.4.2的方法测定咪唑乙烟酸剩余含量，以不接菌培养液作为对照。咪唑乙烟酸降解率的计算公式[17]：

其中：R为降解率，%；c0为对照培养样品咪唑乙烟酸残留量，g/mL；c1为处理样品咪唑乙烟酸残留量，g/mL。

1.5 降解菌MZ-1降解条件的优化

结合预试验结果，影响降解菌降解效率的主要环境因素有pH、温度、接菌量[18]，采用响应面法利用Design-Expert8.0.6 软件中 Box-Behnken design (BBD)模型进行 3 因素 3 水平试验设计，对以上3个关键因素进行优化，以温度(A)、pH(B)、接菌量(C)为自变量，以5 d后降解率为唯一响应值，试验设计因素水平见表1。

表1 试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of experiment design

1.6 降解菌Z-1在最优条件下生长和降解曲线测定

在最优pH、温度、接菌量的条件下将降解菌MZ-1接种于100 mL的基础盐培养基中，咪唑乙烟酸初始浓度为200 mg/L，每隔24 h测定菌液的OD600值和咪唑乙烟酸的降解率，以时间为横坐标，分别以OD600值和降解率为纵坐标，根据时间与OD600值和降解率的对应关系绘制降解菌的生长曲线和降解曲线。

1.7 降解菌MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应

采用培养皿滤纸法，测定了菌株MZ-1对油菜的咪唑乙烟酸的去毒效应[2]。选取大小均匀一致的油菜种子10粒，置于铺有两层滤纸的培养皿中，以灭菌的基础无机盐培养液处理为对照组，将含相同浓度的咪唑乙烟酸培养液分为接菌和不接菌两组处理，5 d后，分别稀释10倍、500倍、1 000倍处理种子，30 ℃恒温黑暗培养3 d后测量根长，计算各稀释倍数咪唑乙烟酸培养处理后对油菜种子根生长的抑制率[19]，每组3次重复。通过抑制率的大小来评价菌株MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应。

其中：Y为抑制率，%；g0为对照组总根长，cm；g1为处理组总根长，cm。

1.8 数据处理与分析

运用SPSS13.0软件对数据进行处理和分析，并进行LSD差异显著性检验(P<0.05)；运用Origin 2018和Design-Expert11进行绘图和响应面分析。

2 结果与分析

2.1 降解菌MZ-1鉴定

2.1.1 降解菌MZ-1的形态及生理生化特性

通过逐级加量驯化的方法，分离筛选出1株对咪唑乙烟酸具有降解能力的细菌，命名为MZ-1，菌落呈近圆形，灰白色，粗糙无光泽，中央稍凸起，边缘不整齐，有的呈缺刻状，在液体LB培养基内生长迅速，常有菌膜或壁环形成。生理生化特性测定结果如表2所示：降解菌MZ-1为革兰氏阳性菌，具芽孢，产生过氧化氢酶和淀粉水解酶，不产生吲哚。

表2 降解菌MZ-1部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of degradation bacteria MZ-1

2.1.2 降解菌MZ-1的系统发育树分析

将PCR测序产物拼接后，在GenBank中的注册号为(MW541635)，经过BLAST对比显示，菌株MZ-1的16S rRNA与蜡状芽孢杆菌(N999893)相似度为100%，构建系统发育树如图1所示。结合形态学观察和生理生化特性及系统发育树分析，初步鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

图1 降解菌MZ-1的16S rRNA系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of degradation bacteria MZ-1 on the 16S rRNA sequence

2.2 降解菌MZ-1降解咪唑乙烟酸响应面优化分析

2.2.1 模型建立及显著性检验

综合考虑各因素对降解菌MZ-1降解咪唑乙烟酸效率的影响，利用响应面分析法对降解温度(A)、pH(B)、接菌量(C)三个因素分析得到最佳降解条件。菌MZ-1响应面分析试验设计及结果如表3所示。由表3可以看出零点试验点的降解率较稳定，在72 %左右。利用Design Expert 8.06软件进行回归拟合，得到咪唑乙烟酸降解回归方程：咪唑乙烟酸降解率Y(%)=71.63+4.85 A-9.62 B+2.02 C+5.5 AB-1.47 AC + 2.26 BC - 8.84 A2-

23.56 B2- 4.46 C2。

表3 Box-Behnken试验结果与分析Table 3 Design results and analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 响应面分析与最优条件确定

温度、pH和接菌量交互作用对咪唑乙烟酸降解率均有显著影响。当接菌量固定时，随着温度和pH的增大，降解率都呈现出先增加后降低的趋势，但随温度变化较平缓，说明温度对降解率影响比pH小，等高线呈闭合的椭圆形说明温度和pH交互作用明显(图2A、2B)；当pH固定时，降解率随温度和接菌量的增大，均呈现出先增加后降低的趋势，但随接菌量变化平缓，说明接菌量对降解率影响比温度小，等高线近圆形，说明温度和接菌量交互作用不明显(图2C、2D)；当温度固定时，pH和接菌量的等高线呈闭合椭圆形，说明pH和接菌量交互作用明显(图2E、2F)。上述分析和表3中方差分析一致。由Design Expert 8.0.6软件分析计算，获得MZ-1降解咪唑乙烟酸的最优条件，为了方便操作对所获得的最优条件进行了修正：降解温度为32 ℃，pH为6.6，接菌量为3%，降解率预测值为73.12%。

图2 各因素交互作用对降解率影响Fig. 2 Response surface and contour of each factors on degradation of imazethapyr

2.3 最优条件下生长和降解曲线测定

在最优降解条件下，菌株MZ-1在咪唑乙烟酸浓度200 mg/L的无机盐培养液中，生长快速，24 h时OD600值达到最大(图3)。随着菌株MZ-1的快速生长，咪唑乙烟酸的降解率逐渐升高，在110 h后，降解率为74.34%，与预测值偏差为1.64%，进一步说明所得优化模型能够较好地预测菌株对咪唑乙烟酸的降解情况。

图3 菌株MZ-1在最优条件下的生长及降解曲线Fig. 3 Growth and degradation curves of strain MZ-1 under optimal conditions

2.4 降解菌MZ-1对咪唑乙烟酸的去毒效应

菌株MZ-1在稀释倍数较高时对咪唑乙烟酸有一定的去毒效应(图4)，稀释倍数较低时，由于咪唑乙烟酸浓度过高，对油菜产生药害极严重，根生长缓慢，两组处理的差异不明显。随着稀释倍数的增加，经方差分析发现，不同处理对油菜种子根生长的抑制率差异显著。当稀释倍数为500倍(500×)时，不接菌处理对油菜根长抑制率为51.95%，接菌处理组对根长抑制率为45.40%，而当稀释倍数为1 000倍(1 000×)时，接菌处理组的抑制率为18.91%，仅为不接菌处理抑制率的52.45%。表明降解菌MZ-1能有效降低咪唑乙烟酸对后茬敏感作物油菜的毒性，对咪唑乙烟酸有明显的去毒效果。

图4 两种处理对油菜种子生长的影响Fig. 4 Effects of two treatments on seed growth of rape seeds注：图中不同字母表示同一稀释浓度下接菌处理与不接菌处理在p≤0.05水平上差异显著。

3 结论与讨论

本研究筛选出一株对咪唑乙烟酸有降解能力的蜡状芽孢杆菌MZ-1。利用响应面法得到该菌对咪唑乙烟酸的最佳降解条件：温度为32 ℃，pH为6.6，接菌量为3%，在此最优条件下，菌株MZ-1在5 d后对初始浓度为200 mg/L的咪唑乙烟酸预测降解率为73.12%。经过菌株MZ-1对咪唑乙烟酸去毒效应研究发现，稀释倍数较高即咪唑乙烟酸浓度较低时，两组处理差异显著，接菌处理组对油菜种子根生长抑制率显著低于不接菌处理组，表明菌株MZ-1对咪唑乙烟酸残留毒性有去毒效应。

蜡状芽孢杆菌是一类兼性好氧、能产生抗逆性芽孢的革兰氏阳性细菌，具有遗传稳定性强、耐高温和抗逆性强等特性，是一类重要的资源微生物，在农药及难降解有机物残留污染的生物修复中有十分广泛的应用前景[20]。目前，关于蜡状芽孢杆菌降解农药等难降解有机物的报道较多，如陈贝贝等[21]，从棉田土壤中分离得到一株蜡状芽孢杆菌D8，3 d后对氟乐灵的降解率达59.89%；张成等[22]筛选出一株蜡状芽孢杆菌WL08，对烯酰吗啉有较高降解能力，在最优条件下游离的WL08在72 h内可将初始浓度为50 mg/L的烯酰吗啉降解66.95%。此外，蜡状芽孢杆菌对有机磷农药残留污染的修复也有较好效果[23]。本研究分离得到的蜡状芽孢杆菌对咪唑乙烟酸有较高降解能力，目前未见其他有关蜡状芽孢杆菌降解咪唑乙烟酸的报道。

微生物对除草剂降解的研究已经取得较大进展，降解菌菌库也得到不断的补充，但在实际应用中还面临许多问题，主要就是这些降解微生物往往易受到复杂环境条件的影响[24]，如pH和土壤中有机质含量。有研究表明，尽管在不同 pH 的熟化土壤中咪唑乙烟酸保持相似的含量，但低pH条件下被土壤吸附的咪唑乙烟酸很快释放, 而高pH条件下土壤吸附的咪唑乙烟酸难以快速解吸附[25]。本研究从温度、pH和接菌量三个方面对菌株MZ-1降解条件进行优化，探究其在不同条件下的降解能力。结果表明pH对咪唑乙烟酸降解效率的影响最大，且最优条件下的pH为6.6，呈弱酸性。因此，菌株MZ-1在实际应用中可以通过调节环境pH呈弱酸性，保持菌株的降解条件在较优水平，使咪唑乙烟酸更易释放，从而进一步提高降解效率。

本研究对降解菌MZ-1的分类学地位，降解特性进行了初步研究，对其降解条件进行了优化，并以油菜种子根生长抑制率为标准，对其去毒效应进行了评价。但有关该菌株的代谢途径，降解产物的成分以及其有关降解基因的克隆和降解酶制剂等相关方面还有待进一步深入研究。