伽师瓜无菌播种及愈伤组织诱导技术初探

卡力比努尔·艾沙，图尔荪妮萨·艾合麦提，热依拉·艾买尔，李 爽，赵 亮

喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844006

伽师瓜的种植历史十分久远，在南北朝时，伽师瓜因其独特的口感而获得较高的评价。在清朝时期，伽师瓜被献给当时的朝廷重臣和皇族。“伽师”甜瓜因其肉质厚细、香甜清脆、浓汁、皮薄无网纹、耐储存等特点，具有“中国瓜王”的称号。伽师瓜原产于新疆喀什地区的伽师县，伽师县地处新疆西南地区，具有西高东低，北高南低的独特地势，具有适宜的独特气候和水土条件。伽师瓜是喀什地区特色经济作物，也是伽师县农牧民收入的主要来源。伽师瓜外观优美，含糖量高，香甜可口，肉厚汁丰，品质优良，风味独特，营养丰富，在食品加工、医学等方面也有很多用途。据调查，目前伽师瓜在生产中主要存在品种退化，病虫害；单果大小差异大等问题，通过植物组织培养技术获得优良康尼基因，进而明确这些基因的功能是十分必要的。

将植物组织培养技术、细胞融合技术以及诱变育种等技术结合起来应用，可大大缩短作物遗传改良所需的年限，获得优良抗逆性状。利用植物组织培养技术，获得优良抗逆基因在林果栽培种已有应用，如减少植株和瓜果的病虫害，有望实现在其他地区栽培，这也许能给南疆更多的农牧民生产增收带来巨大效益。但前提是通过植株离体再生培养，获得遗传背景一致的再生苗，从而获得稳定的优良基因。目前，就伽师瓜离体再生技术而言，关于其无菌播种和愈伤组织的诱导的最佳条件并没有给出统一的答案。因此，本研究选择伽师瓜为试验材料，以离体子叶和茎段开展愈伤组织诱导技术的研究，旨在掌握植物组织培养的基本技能，为建立伽师瓜幼苗离体再生体系提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

伽师瓜种子购自于喀什农博城种子专营店，常规种。

1.2 无菌播种

参考朱新霞等人的方法配制MS培养基，调节至pH（5.9±0.1），于高压灭菌锅中121℃条件下灭菌20min。种子分别为去壳和不去壳处理，分别经75%酒精消毒60s，10%次氯酸钠或0.1%氯化汞消毒15min，在超净工作台上待种子晾干，播于MS培养基上，每瓶播种5粒。

1.3 愈伤组织诱导实验方法

取5d的伽师瓜无菌苗，在无菌条件下，将子叶除去边缘切成0.5cm×0.5cm的小块，接种于含不同浓度的6-BA的培养基中（0.2mg/L6-BA＋MS、0.4mg/L6-BA＋MS、1.0mg/L6-BA＋MS、2mg/L6-BA＋MS），每瓶中接种8块；将茎部切为每段0.5cm的茎段，接种于含不同浓度的6-BA的培养基中（0.2mg/L6-BA＋MS、0.4mg/L 6-BA＋MS、1.0mg/L6-BA＋MS、2mg/L6-BA＋MS），每瓶接种8块。将接种好的培养瓶放置在2200lx光照下培养，每2d观察一次愈伤组织生长情况，约30～40d后统计愈伤组织的数量，并计算愈伤组织诱导率。

2 结果分析

2.1 不同处理方法对无菌苗生长的影响

如表1所述，去壳的种子与未去壳的种子相比，去壳的种子在MS培养基中更容易发芽，分别用次氯酸钠和氯化汞消毒后伽师瓜种子萌发率达到85%和90%，生长的无菌苗污染率低。未去壳的种子，尽管用次氯酸钠和氯化汞消毒后，种子也仅有一半萌发。

表1 未去壳的种子与去壳的种子形成无菌苗的概率

2.2 不同部位的外植体对愈伤组织诱导的影响

6-BA诱导茎段形成的愈伤组织见表2，可以看出浓度为0.4mg/L6-ba+ms的培养基中，茎段的诱导率为达到93%。在没有加入6-ba的培养基中诱导率为0。接种在1.0mg/L6-ba+ms和2.0mg/L6-ba+ms的培养基上的茎端，尽管也能诱导形成愈伤组织，愈伤组织褐变率较高。

表2 含不同浓度6-BA对诱导茎段形成愈伤组织的影响

不同浓度6-BA诱导子叶形成的愈伤组织见表3，其中浓度为0.4mg/l6-ba+ms的培养基中的诱导率为最高达到90.6%。在没有加入6-ba的培养基中诱导率为0。接种在1.0mg/l6-ba+ms和2.0mg/l6-ba+ms的培养基上的子叶，愈伤组织褐变率较高。

表3 不同浓度6-BA对诱导子叶形成愈伤组织的影响

3 讨论与结论

本实验过程中，无菌操作对种子的消毒灭菌处理很重要，将伽师瓜常规种去壳与未去壳对比，去壳种子的发芽率更高，这与王爱玲等人的实验结果一致[8]。未去壳种子由于外种皮的存在萌发时要突破培根，萌发时间更长，且外壳带有细菌，生长的无菌苗易受到污染，而去壳种子可直接萌发，发芽率更高。多次实验证明一旦无菌苗染菌，那么以其作为外植体的愈伤组织诱导期间也会染菌。所以在对除去外壳的种子灭菌时要严格对外植体消毒充分。

在探究诱导愈伤组织最佳部位、最适6-BA浓度时，本实验通过控制培养基的6-BA浓度，得出以茎部与子叶为外植体在0.4mg/L的6-BA+MS培养基中形成的愈伤组织最好，这结果与付秋实等人的研究结果稍有差异。6-BA浓度过低不容易生成愈伤组织，孙敬三等研究表明，随着6-BA浓度升高，组织块的玻璃化也愈严重。这可能与内外源激素达到特定得平衡状态和激素受体存在饱和状态有关。

通过实验所得数据可明显看出，在浓度为0.4mg/L6-ba+ms的培养基中,以茎部作为诱导愈伤组织的外植体时，其诱导率都比子叶作为外植体时的诱导率高出2.4%。表明在相同培养条件下，即使是同一植株的不同外植体，其愈伤组织的诱导能力也不同，这可能与构成不同外植体的细胞生长发育规律及调节其生长的内源激素有关，这与孙庆军等人的研究结果相似。其结果表明，在不定芽诱导过程中，除甜瓜子叶和下胚轴能产生不定芽外，其余外植体均未能诱导出不定芽。本实验表明，伽师瓜只有在茎段形成的愈伤组织可以分化出不定芽来，这刻与孙庆军等人的研究材料、外植体生理状态及培养基配比不同有关。

本实验得出，伽师瓜无菌播种的最佳方式为：种子除去外壳，在75%的酒精中处于黑暗条件下培养成无菌幼苗；伽师瓜的愈伤组织诱导的最佳条件为：以5d的无菌苗茎部为外植体，在0.4mg/L6BA+MS培养基中诱导形成的愈伤组织最好。