GLP-1通过调节巨噬细胞泡沫化抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用机制研究

厍广东，陈娟，代小敏，韩霞

动脉粥样硬化（AS）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑卒中等的主要病理基础[1]。AS作为一种慢性炎症疾病，局部或全身性的免疫反应始终贯穿发病过程，而巨噬细胞在其中起到重要作用[2]。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种新型降糖药物，具有低血糖反应少、对体重影响小的优点，已广泛应用于临床，其心血管保护作用也成为临床关注的热点[3]。目前GLP-1对AS的作用及具体机制尚未完全清楚，载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠能短期内形成类似人类病理特征的AS斑块，是研究AS病理的良好模型。本研究旨在分析GLP-1是否能影响高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠体内巨噬细胞泡沫化及动脉粥样斑块发生发展，以期为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器6周龄雄性ApoE-/-小鼠（广东省医学部动物实验中心）。小鼠体重17～22 g，平均（19.1±1.7）g，均在SPF级环境中饲养，环境温度22～25 ℃。GLP-1（7-36）、GLP抑制剂Exendin（9-39）均购自成都凯捷生物医药有限公司；高脂饲料（北京科澳协力饲料有限公司）；苏木素-伊红染色液（上海联迈生物工程有限公司）；红油O染色试剂盒（美国Sigma公司）；蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司）；细胞裂解液（美国Sigma公司）；鼠抗人SR-A、CD36一抗（美国R&D公司）；FITC标记的IgG二抗（美国Invitrogen公司）；β-action（美国Santa Cruz公司）；全自动生化仪（迈瑞BS-280型）；显微镜（日本Olympus BX41型）。

1.2 小鼠分组及处理将40只ApoE-/-小鼠随机均分为对照组、模型组、GLP-1组和GLP-1阻断组，每组各10只。其中，对照组采用普通饲料喂养，其余三组采用高脂饲料喂养，高脂饲料为含10%猪油和1.25%胆固醇的饲料，喂养12周。于8周末开始，GLP-1组小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2 nmol/（L·kg），GLP-1阻断组小鼠每天腹腔注射GLP-1 2.2nmol/（L·kg）和Exendin22 nmol/（L·kg）。两组均连续注射4周，对照组和模型组腹腔注射等量生理盐水。本研究经医院动物管理委员会审核通过。

1.3 血清学检测喂养12周后采集小鼠静脉血，待血液凝固血块收缩后以4000 r/min离心10 min，取上清液，采用全自动生化仪检测小鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

1.4 小鼠主动脉病理学形态观察采集血液样本后剪开右心耳，采用磷酸盐缓冲液从左心室灌注至右心房流出，分离主动脉并在4% HCHO溶液中过夜，在蔗糖浓度梯度溶液中脱水，包埋、制备组织切片（5 μm），进行HE染色观察血管内斑块大小、管腔狭窄程度、泡沫细胞形成等病理变化。

1.5 小鼠腹腔巨噬细胞分离及泡沫细胞脂滴形成检测小鼠处死后在其腹腔中注射2 ml预冷的PBS缓冲液，轻揉小鼠腹部并将腹腔液吸出，重复操作3次后，放置于5 ml离心管中，以2000 r/min离心10 min，弃去上清液后加入DMEM重悬；再次离心弃去上清液，在沉淀细胞中加入RPMI 1640培养液重悬；将得到的巨噬细胞在4% HCHO溶液中国定10 min，采用油红O染色1 min，其后采用60% C3H8O溶液清洗2次、超纯水漂洗3次，在显微镜下观察细胞泡沫化状况并拍照。

1.6 RT-PCR检测巨噬细胞中CD36、SR-A mRNA表达在获取的巨噬细胞中加入细胞裂解液提取总RNA，逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，反应条件：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共35 cycles后72℃延长7 min，分别取CD36、SR-A扩增产物10 μl进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线透射反射分析仪下拍照。采用凝胶分析系统和ID Image分析软件对产物进行灰度图像分析，以β-action为内参，计算CD36、SR-A mRNA的相对表达量。引物序列：CD36上游3'- GGAGGCATTCTCATGCCAGT -5'，下游3'- CTGCTGTTCTTTGCCACGTC -5'，SR-A上游3'- ATCTTCCACCAAGGCCAGTG -5'，下游3'- CCTAGACTCCGGCAGACAAC -5'。

1.7 Western blot检测细胞中CD36、SR-A蛋白表达采用含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液加入到巨噬细胞中，以12 000 r/min离心15 min来提取上清液中总蛋白；BCA法测定蛋白浓度后，进行SDSPAGE电泳、200 mA恒流电转膜、含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入CD36、SR-A一抗（1:1000稀释），4℃过夜；二抗室温孵育60 min，采用化学发光法显色，采用成像扫描分析系统进行拍照和图像保存，并计算CD36、SR-A蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件包对数据进行统计分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠血脂水平比较与对照组比较，模型组、GLP-1组、GLP-1阻断组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，GLP-1组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平降低（P＜0.05）；与GLP-1组比较，GLP-1阻断组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高（P＜0.05），（表1）。

表1 各组小鼠血脂水平比较

2.2 各组小鼠主动脉病理学形态观察HE染色结果显示，对照组小鼠主动脉血管内壁清晰、无斑块形成；模型组斑块病变最严重，斑块内可见大量胆固醇结晶，泡沫细胞数量较多，管腔高度狭窄；与模型组比较，GLP-1组主动脉壁黏膜层只有局部薄层粥样斑块，泡沫细胞数目减少，管腔轻度狭窄；而GLP-1阻断组与GLP-1组相比粥样斑块面积和厚度增加，泡沫细胞和淋巴细胞增加（图1）。

图1 各组小鼠主动脉HE染色结果（40×）

2.3 各组小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化状况比较与对照组比较，模型组、GLP-1组、GLP-1阻断组小鼠腹腔泡沫细胞形成明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，GLP-1组泡沫细胞形成减少（P＜0.05）；与GLP-1组比较，GLP-1阻断组泡沫细胞形成增加（P＜0.05），（图2～3）。

图2 各组小鼠腹腔巨噬细胞油红O染色结果（200×）

2.4 RT-PCR检测巨噬细胞中CD36、SR-AmRNA表达与对照组比较，模型组、GLP-1组、GLP-1阻断组巨噬细胞中CD36、SR-A mRNA表达明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，GLP-1组巨噬细胞中CD36、SR-A mRNA表达减少（P＜0.05）；与GLP-1组比较，GLP-1阻巨噬细胞中CD36、SR-A mRNA表达增加（P＜0.05），（图4～5）。

图3 各组巨噬细胞泡沫化比例比较

图4 三组腹腔巨噬细胞CD36 mRNA相对表达量比较

2.5 Western blot检测巨噬细胞中CD36、SR-A蛋白相对表达量与对照组比较，模型组、GLP-1组、GLP-1阻断组巨噬细胞中CD36、SR-A 蛋白表达明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，GLP-1组巨噬细胞中CD36、SR-A 蛋白表达减少（P＜0.05）；与GLP-1组比较，GLP-1阻巨噬细胞中CD36、SR-A 蛋白表达增加（P＜0.05），（图6～7）。

图6 腹腔巨噬细胞CD36、SR-A蛋白表达图

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）是一种由动脉管壁上胆固醇累积引发的慢性炎症反应疾病。巨噬细胞的泡沫化和凋亡不断累积可加速动脉粥样斑块不稳定和破裂，是促进AS发生发展的主要因素[4,5]。研究发现，胰高血糖素样肽1（GLP-1）可有效改善心肌能量代谢和内皮细胞功能障碍，从而减少心血管疾病的发生[5]。本研究旨在观察GLP-1对巨噬细胞泡沫化形成及AS发展的影响，为临床抗AS治疗提供新的思路。

图5 三组腹腔巨噬细胞SR-A mRNA相对表达量比较

图7 各组细胞CD36、SR-A 蛋白相对表达量比较

载脂蛋白E基因（ApoE）主要参与机体脂蛋白代谢过程，而ApoE-/-小鼠在高脂饮食条件下，可在较短时间内形成类似人体的AS病变从而成为常用的AS动物模型[6]。本研究中我们采用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠，结果显示：与对照组比较，其他三组高脂饮食血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均偏高，且GLP-1组TC、TG、HDL-C、LDL-C水平低于模型组、GLP-1阻断组TC、TG、HDL-C、LDL-C水平高于GLP-1组，提示高脂饮食可引发外周血中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平升高，而GLP-1可缓解体内脂质水平的过度升高。外周血中胆固醇代谢稳态受巨噬细胞等特殊细胞调节，因此推测GLP-1可能通过调节巨噬细胞来参与体内胆固醇代谢。

泡沫细胞与AS发展关系密切，而泡沫细胞的产生主要来源于巨噬细胞和平滑肌细胞中LDL的大量涌入及胆固醇的超负荷沉积[7,8]。正常内环境中，巨噬细胞是血浆脂蛋白代谢的主要调节因子[9]。在内皮细胞的促炎激活反应中，巨噬细胞穿透内皮屏障并在动脉内膜中积累，成为机体中泡沫细胞的重要来源[10,11]。内皮下聚集的泡沫细胞不断形成超负荷脂质的动脉粥样斑块，在AS发生发展的整个阶段中都发挥着重要作用[12]。此外，巨噬细胞的泡沫化主要来自于细胞中出现胆固醇的沉积，具体表现为胆固醇摄取增加和外流减少，而清道夫受体在其中发挥重要作用[13]。巨噬细胞表面同时表达LDL受体和清道夫受体，其中LDL受体可介导细胞摄取脂质，此过程受到细胞内脂质含量的反馈调节；而CD36、SR-A等清道夫受体所介导的脂质摄入过程不受到细胞内脂质的反馈抑制，在脂质摄入过程还可促进自身表达水平的增加，从而加剧游离和酯化胆固醇在巨噬细胞中的沉积[14-16]。本研究发现，与对照组比较，其他三组泡沫细胞形成、CD36、SR-A mRNA及蛋白相对表达量明显增加，且GLP-1组低于模型组、GLP-1阻断组低于GLP-1组，提示GLP-1可抑制巨噬细胞的泡沫化状况，推测原因可能是GLP-1能通过调节清道夫受体CD36、SR-A表达从而影响巨噬细胞的泡沫化过程。有学者发现，GLP-1受体激动剂对高血脂症小鼠有抗AS作用，且巨噬细胞在主动脉壁的浸润受到明显影响[17]。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂可抑制DPP-4对GLP-1的降解，有学者采用DPP-4抑制剂注射ApoE-/-小鼠，发现其体内的CD36、SR-A和清道夫受体LOX-1的表达量相对模型组明显下调，提示GLP-1表达增加可抑制CD36、SR-A表达[18]。GLP-1类药物已成为新一代降糖药物，糖尿病合并AS不仅增加血糖管理难度，还会对患者生命健康造成不利影响。本研究表明GLP-1通过影响巨噬细胞泡沫化从而影响AS进程，也为DM患者并发AS的综合防治提供参考。