基于网络药理学探究络风宁2号方治疗慢性心力衰竭的作用机制

吴洋，王宇，王显,2

心力衰竭（心衰）是由多种原因导致心脏的结构或功能异常，从而使心室收缩或舒张能力受损的复杂临床综合征，主要表现为呼吸困难、乏力及液体潴留（肺淤血、外周水肿）等[1]。高润霖院士团队所做的我国心衰流行病学调查的最新结果显示，心衰的发病率上升，在我国年龄≥35岁居民中，加权的心衰患病率为1.3%，即约有1370万心衰患者[2]。我国132家医院13 687例注册登记的心衰患者的数据分析显示，心衰患者的住院死亡率约4.1%[3]。目前治疗慢性心力衰竭（CHF）的常用临床药物包括血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、利尿剂等[4]，但仍有部分患者出现喘憋、水肿等症状。中医药在改善心衰患者的生活质量和预后方面的作用逐渐被认可，因此心衰的治疗需要中医药的参与[5]。

络风宁2号方是北京中医药大学东直门医院王显教授治疗慢性心衰的经验方，其是在益气温阳、活血利水的基础上，加用祛风通络法而成，它由徐长卿、熟附子、桂枝、茯苓、泽泻、人参、黄芪、三七、荜拨、威灵仙10味药组成[6]。课题组通过前期临床试验、动物实验证实，络风宁2号方对心衰具有良好的疗效，能改善心衰症状及心功能，抗心肌纤维化等[7-9]。

网络药理学通过数据库和计算机程序对中药复方进行多途径、多靶点的预测，在很大程度上节省人力物力，提高科研效率，具有整体性、系统性的特点，与中医的“整体观念”有着异曲同工之妙[10]。由于中药复方成分复杂，药物作用于疾病的靶点众多，以及靶点、通路之间关系复杂，本研究基于网络药理学方法，预测络风宁2号方治疗心衰的靶点通路、作用机制，为络风宁2号方今后的实验研究及药物开发提供参考。

1 资料与方法

1.1 络风宁2号方中化合物及其潜在靶点预测利用TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索徐长卿、附子、桂枝、茯苓、泽泻、人参、黄芪、三七、荜拨、威灵仙的化合物及对应靶点。

1.2 慢性心衰的靶点的收集以“Chronic heart failure”为关键词，检索GeneCards数据库得到慢性心衰的相关靶点和基因。

1.3 络风宁2号方治疗慢性心衰共同靶点的筛选将络风宁2号方、慢性心衰的相关基因利用在线韦恩分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）获络风宁2号方治疗慢性心衰的共同靶点。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选蛋白质是生物体内的信号传递、基因调控、物质能量代谢等生命过程中的重要物质，PPI网络对于阐释这些蛋白质的功能联系具有重要的作用，运用生物信息学的方法建立PPI网络由繁入简，从而了解蛋白质在疾病治疗中的生物学作用。将在线韦恩分析工具得到的交集靶点运用String（https://string-db.org/）数据库，“Organism”设为“Homo sapiens”，构建PPI网络。将PPI网络数据导入EXCEL表格，利用Cytoscape3.7.1软件进行可视化处理。

1.5 基因富集分析将络风宁2号方治疗慢性心衰的潜在共同靶点利用FunRich完成基因功能分类（GO）和信号通路富集（KEGG）分析，GO分析设定阈值P＜0.05，分别选取细胞组成（CC）、生物学过程（BP）、分子功能（MF）中排名前20的条目进行可视化。KEGG信号通路富集分析选择与疾病相关的信号通路进行可视化。

2 结果

2.1 络风宁2号方化合物及靶点疾病靶点预测结果通过TCMSP检索到制徐长卿化合物68个、附子化合物65个、桂枝化合物220个、茯苓化合物34个、泽泻化合物46个、人参化合物190个、黄芪化合物87个、三七化合物119个、荜拨化合物104个、威灵仙化合物57个，以药物标准OB≥30%及DL≥0.18为条件筛选出络风宁2号方活性化合物133个，根据OB进行排序，络风宁2号方的部分活性化合物（表1）。这些化合物包括：二氢异黄酮、植保菌素、惰碱、芒柄花黄素、水黄皮次素、花旗松素、芝麻素、槲皮素、人参皂苷rh2等。通过TCMSP检索到徐长卿、附子、桂枝、茯苓、泽泻、人参、黄芪、三七、荜拨、威灵仙活性化合物的相关靶点基因1372个。检索Genecard数据库得到慢性心衰中score≥5的相关靶点4655个。

表1 络风宁2号方活性化合物

2.2 络风宁2号方与慢性心衰的相关基因及活性成分-靶点网络的构建将络风宁2号方、慢性心衰的潜在靶点经过韦恩分析后，获得两者的共有交集97个靶点。韦恩图（图1），药物和疾病靶点的关系（图2）。

图1 络风宁2号方与慢性心衰的韦恩图

图2 络风宁2号方和慢性心衰的相关基因及活性成分-靶点网络

2.3 靶点蛋白的交互作用网络由PPI网络图（图3）可知，该网络包含93个节点蛋白及1788条相互作用的连线。以节点度值为评价参数，节点度值越大说明其在PPI网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用；从颜色来看，节点度值由大到小，其节点颜色由蓝绿黄橙依次渐变。度值排名前十的靶点为IL6、VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8、DECR1、MYC、ESR1、CCND1、PPARG，提示这些靶点可能是络风宁2号方发挥治疗作用的关键靶点。

图3 络风宁2号方对慢性心衰作用靶点的蛋白互作网络图

2.4 潜在作用靶点的GO分析将络风宁2号方治疗慢性心衰的共有靶点导入FunRich软件进行GO富集分析，得到P＜0.05的生物学功能条目1313条，其中P＜0.05的生物过程、细胞成分、分子功能条目分别有1162、45、106条，各选取前20条进行可视化（图4～6）。

图4 GO富集-生物过程

根据GO富集分析的结果得出，络风宁2号方中活性成分的生物过程主要富集在类固醇激素反应、对外来生物刺激的反应、脂肪酸代谢过程、氧化应激反应、活性氧代谢过程、抗生素反应、脂多糖反应、对细菌来源分子的反应、对氧水平的反应、凋亡信号通路的调控、对营养水平的反应；在细胞组成中膜筏、膜微结构域、膜区域、核染色质、突触后膜、突触膜所占比例最大；在分子功能方面，DNA结合转录激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、核受体的活动、转录因子活性、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、类固醇激素受体活性、肽链内切酶活性排位靠前。

图5 GO富集-细胞成分

图6 GO富集-分子功能

2.5 潜在作用靶点的KEGG分析将络风宁2号方治疗慢性心衰的共有靶点导入David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行 KEGG通路富集分析，筛选得到P＜0.05的条目110条，选取P＜0.05的前20条进行可视化展示（图7）。根据KEGG通路结果，其中排名靠前的通路包括PI3KAkt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）、内分泌的阻力（Endocrine resistance）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、细胞衰老（Cellular senescence）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等通路（图8～9）。

图7 KEGG通路富集图

图8 PI3K-Akt信号通路

图9 Ras信号通路

3 讨论

基于网络药理学研究中药复方，是从整体的角度认识中药与人体之间的关系，充分地体现了中医的整体观念[11]。它以“疾病-基因-靶点-药物”为研究基础，结合计算机模拟计算，从而预测药物可能的作用靶点，为药物治疗某种疾病提供理论基础[12,13]。

慢性心衰主要的病理生理基础在于心室重构，心室重构的基本特征包括心肌细胞凋亡、心肌肥厚、心肌纤维化，因此，它会导致心功能不全，增加心血管不良事件的发生率，增加死亡率[14]。治疗慢性心衰的关键在于抑制心室重塑，延缓或阻止心肌纤维化。杨雪卿等[7]通过结扎前降支法制作心梗后慢性心衰大鼠模型，利用络风宁、卡托普利对慢性心衰大鼠进行4周干预，结果证明络风宁2号方具有改善慢性心衰大鼠心功能及抗心肌纤维化等的作用。

络风宁2号方以徐长卿为君药，熟附子、桂枝、茯苓、泽泻共为臣药，人参、黄芪、三七共为佐药，荜拨、威灵仙共为使药。其中徐长卿益气活血、祛风通络，熟附子、桂枝共同发挥温补阳气的作用，熟附子温补心肾阳气，桂枝祛风散寒，温阳行气，茯苓、泽泻祛风健脾消肿，利水渗湿，人参益气生津，温阳益肺，黄芪补气升阳、固表止汗、利水消肿。络风宁2号方中主要中药的现代药理研究显示，徐长卿具有增加冠脉血流， 改善心肌代谢等的心血管作用，以及抗炎、调节免疫等作用[15]。附子的主要成分包括乌头类生物碱及黄酮类，其对于心力衰竭、休克有较好的强心作用，能双重调节心律失常，同时具有良好的保护心肌和抗炎镇痛的作用[16]。人参的主要成分人参皂苷Re具有改善心肌缺血，减轻心肌缺血再灌注损伤，减轻心肌细胞的凋亡的作用[17]。茯苓的主要成分为三萜类、多糖类及甾醇类，有实验显示茯苓可下调水通道蛋白2的mRNA和蛋白表达，以及下调血液中加压素2型受体mRNA、精氨酸加压素的水平，以改善心衰大鼠的心脏功能及尿潴留情况[18]。

本研究构建的络风宁2号方的网络图表明，络风宁2号方可通过影响神经信号转导通路、心肌细胞通路以发挥改善慢性心衰的作用。通过筛选共得到133个活性成分和371个靶点基因，通过Venn图得出与慢性心衰的共同靶点97个。通过PPI互作网络分析，蛋白网络互作关键蛋白排名前十的靶点包括生长因子相关受体（VEGFA、EGFR），蛋白激酶相关受体（MAPK8）以及炎症相关受体（IL-6）等。通过GO富集和KEGG通路富集分析得出，络风宁2号方治疗慢性心衰的作用机制主要涉及氧化应激反应、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡等。心室重构是一系列复杂变化，Zhong等[19]研究表明，氧化应激、炎症、自噬、凋亡等细胞机制参与了心室重构，络风宁2号方可能通过氧化应激、炎症、自噬、凋亡等改善心室重构，进而发挥改善慢性心衰症状的作用。

在PPI分析结果中，IL-6是络风宁2号方治疗慢性心衰相关性最高的靶点。Jones等[20]研究发现，IL-6是一种炎症因子，在炎症、自身免疫、肿瘤中发挥了重要作用。此外，Fontes等[21]研究发现长期持续的IL-6信号导致心肌细胞功能下降，即收缩能力下降，左室增大，肥大基因发生逆转，最终可能导致心衰，其发生过程为IL-6和IL-6受体结合，激活信号转导受体复合物gp130，IL-6受体与gp130结合的下游信号，通过JAK-STAT、RAS-MAPK或PI3K通路，从而参与心血管系统疾病的发生与发展。

PI3K作为胞内磷脂酰肌醇激酶的一种，具有催化磷脂酰肌醇，进而募集、激活下游靶分子的作用，PI3K-AKT信号通路参与细胞增殖调控，调节细胞生长、迁移、凋亡等活动，从而促进细胞生长，抑制细胞凋亡等生理过程[22]。相关研究表明，PI3K-AKT信号通路在心肌肥厚、心肌细胞凋亡、血管再生的调节以及代谢等方面发挥着重要的作用，这些生理过程与心力衰竭的发展过程密切相关[23,24]。MAPK信号通路是介导信号传导并作出反应的系统，它将信号从细胞膜传到细胞核，主要有3组信号通路：外信号调节激酶、c-Jun氨基末端激酶以及p38-MAPK，参与细胞增殖、分化、转化以及凋亡的调节，与炎症、肿瘤等关系密切[25]。此外，已有基础研究证实多种中药通过MAPK通路改善动物心肌肥厚、心肌纤维化以及心室重构[26-28]。Qian等[29]认为cAMP信号通路是细胞内信息传导系统中重要的一部分，其作用在于参与调控细胞增殖、分泌、代谢及凋亡等生理过程。cAMP信号通路在心力衰竭和动脉粥样硬化发挥着重要的作用，Lin等[30]通过miR-665导致心衰大鼠模型细胞凋亡以及GLP1R和cAMP信号通路抑制，表明抑制miR-665可通过上调GLP1R和cAMP信号通路来稳定心衰大鼠的心功能。Zhang等[31]通过阿司匹林干预动脉粥样硬化的小鼠模型，发现阿司匹林通过抑制NFκB1表达及阻断cAMP信号通路发挥治疗动脉粥样硬化的作用。

4 总结

本研究基于网络药理学技术，初步阐述了络风宁2号方治疗慢性心衰的活性成分、有效作用靶点、靶点蛋白以及发挥药效的生物学通路。研究结果初步阐释了络风宁2号方治疗慢性心衰的作用机制和原理，为深入研究其药理作用提供方向和参考。然而，由于本研究主要通过数据挖掘、计算机模拟对络风宁2号方治疗慢性心衰的药效机制预测，预测结果仍需细胞实验、动物实验等进一步验证。