羧基改性多孔磁性壳聚糖微球共固定化葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶 *

柳有财，蔡 俊

(湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，工业微生物湖北省重点实验室，武汉 430068)

0 引 言

葡萄糖酸钠是葡萄糖的一种深加工产品，可以用于制备葡萄糖酸盐(铜、锌、亚铁盐)与葡萄糖酸内酯等产品[1]，在建筑[2-4]、食品[5]、医药[6]、饲料[7]与洗涤剂[8-9]等方面有着广泛的应用。生产葡萄糖酸钠的方法有生物发酵法[10-11]、均相化学氧化法[12]、电解氧化法[13]以及多相催化氧化法[14]，相较于传统的化学催化工艺，酶催化反应更加绿色、环保[15]，为此本团队拟采用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的级联催化作用将葡萄糖高效转化为葡萄糖酸钠。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶能够在温和的条件下对特定的生化反应进行高效催化。但游离酶在体外反应过程中性能不稳定且难于回收，反应后与产物的分离困难，难以进行连续化的使用，在实际工业领域的应用往往受到限制，我们常将酶进行固定化处理来解决这些问题[16-17]，良好的载体材料是固定化酶成功的重要因素。具有多孔结构的磁性高分子微球有良好的生物相容性，其合成成本低、来源广泛、化学稳定性好且磁响应性优良，是提高酶的应用范围的理想材料。目前已报道有多种天然高分子材料被用作固定化酶载体材料，如纤维素[18]、透明质酸[19]、多巴胺[20]、聚乙二醇[21]等。壳聚糖作为一种功能性生物材料，具有成本低、生态友好、无毒、可再生等优异的性能，且其C2位上的氨基在水溶液中会发生质子化而带正电荷[22-23]，可通过静电吸附以及共价键的作用将带负电荷的葡萄糖氧化酶牢固结合。此外，还可以通过修饰其侧链基团而得到具有新的生物活性的衍生物，这为其作为酶的固定化材料打下基础[24-25]。

壳聚糖上含有-NH2、-OH、N-乙酰氨基等官能团，其中-NH2上含有一对孤电子对，这使其反应活性较其他基团更高[26]，也是壳聚糖通过共价键与酶结合的关键基团，但是壳聚糖分子上可参与反应的氨基基团有限，这在一定程度上限制了它的应用。目前，大部分研究通过化学改性来提高天然高分子材料的载酶量以及生物催化稳定性[18]。张敏等[27]通过化学接枝改性将聚乙烯亚胺引入琼脂糖微球上，结果表明改性后的固定化酶储存效率更高，其对外界环境的耐受性也得到增强。Han研究团队[28]制备得到一种含有羧基的磁性纳米微球并将其用于固定化木瓜蛋白酶，得到的固定化酶系统拥有更高的催化活性和载酶量。然而，关于用羧基修饰壳聚糖微球的文章却很少。

本文在实验室前期实验基础上通过APTES改性多孔磁性壳聚糖微球，使其-OH转化为-NH2，然后在GA的作用下部分转化为-COOH。在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化作用[29]下共固定化葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶，形成了一种新型生物催化剂并进行了酶学性质研究。多孔磁性壳聚糖微球载体的改性及其共固定化GOD与CAT的制备流程如图1所示。随后，采用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线衍射(XRD)对固定化酶进行了表征，探讨了固定化双酶体系的生物催化性能及稳定性，并对游离酶与共固定化酶进行二级结构分析。

图1 PMCSM-COOH@GOD@CAT的制备流程图Fig 1 Preparation process diagram of PMCSM-COOH@GOD@CAT

1 实 验

1.1 材料与试剂

壳聚糖、冰醋酸、液体石蜡、吐温-80、戊二醛、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、N,N-二甲基甲酰胺均来自国药集团化学试剂有限公司；纳米四氧化三铁、过氧化氢酶、EDC、NHS、3-氨丙基三乙氧基硅烷、戊二酸酐均来自上海麦克林生化试剂有限公司；去离子水、葡萄糖氧化酶均由实验室自制。

1.2 仪器与设备

AR1140电子分析天平：奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；IKA RW20数显电动搅拌器：艾卡(广州)仪器设备有限公司；D27-6090真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FD-2真空冷冻干燥箱：北京博医康实验仪器有限公司；BTI酶标仪：基因有限公司；RESERVOIR TRAY高效液相色谱仪：SHIMADZU CORRORATION；VEGA 3LMU扫描电子显微镜：TESCAN, Czech Repulic；TNZ1-5700傅里叶红外光谱仪：Nicolet Co, America；D-Advance X-射线衍射仪：Bruker, USA。

1.3 方法

1.3.1 多孔磁性壳聚糖微球的制备

称取一定量的壳聚糖粉末溶于1%冰醋酸溶液中，制备得1%的壳聚糖溶液，在常温下高速搅拌4 h，搅拌结束后再在70 ℃下加热降解4 h，随后滤除不溶物，将滤液超声降解20 min后，得到壳聚糖溶液，放入4 ℃冰箱中储存。取12 mL上述壳聚糖溶液，加入0.2 g Fe3O4，超声分散10 min。在250 mL烧杯中加入108 mL液体石蜡和3.24 mL吐温-80，在常温下充分搅拌30 min后加入上述Fe3O4-壳聚糖溶液(转速为600 r/min)。搅拌1 h后加入0.5 mL 25%的戊二醛溶液，继续反应2 h。反应结束后用磁铁将产物分离，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇和去离子水洗涤数次，洗去表面活性剂和有机溶剂，真空冷冻干燥后得多孔磁性壳聚糖微球，记PMCSM。

1.3.2 羧基修饰多孔磁性壳聚糖微球的制备

羧基修饰多孔磁性壳聚糖微球是利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与戊二酸酐(GA)制备获得。具体方案如下，在250 mL烧杯中加入1.74 mL APTES，0.84 g 戊二酸酐以及60 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，在常温下搅拌3 h。随后加入1.2 g多孔磁性壳聚糖微球，9 mL去离子水以及100 mL DMF溶液，在常温下继续搅拌5 h，最后在外部磁铁的作用下，用去离子水与无水乙醇清洗依次洗涤若干次，真空冷冻干燥后保存于干燥器中。记PMCSM-COOH。

1.3.3 共固定化葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶

取100 mg上述制备好的PMCSM-COOH置于PB缓冲液中，加入200 μL EDC，震荡30 min后加入200 μL NHS，继续震荡30 min后加入一定体积的葡萄糖氧化酶溶液(0.6～1.6 mL)。反应一定时间后，通过外加磁场将固定化酶与反应液分离，去离子水洗涤3次，得到载葡萄糖氧化酶的羧基修饰多孔磁性壳聚糖微球，记PMCSM-COOH@GOD。取上述得到的PMCSM-COOH@GOD于三角瓶中，加入NHS溶液，震荡30 min后加入一定体积的过氧化氢酶溶液(0.6～1.6 mL)，反应一定时间后，通过外加磁场将固定化酶与反应液分离，去离子水洗涤3次，最终得到载葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的多孔磁性壳聚糖微球，记PMCSM-COOH@GOD@CAT。

1.3.4 葡萄糖氧化酶酶活的测定

用pH值=6.5缓冲液配制浓度为20 g/L的葡萄糖溶液，分别在两个250 mL三角瓶中加入25 mL上述溶液，其中一组加入待测固定化酶，立即放在摇床上于30 ℃，180 r/min震荡反应1 h，取出后加入0.1 mol/L标准NaOH 20 mL使氧化反应停止。在上述混合液中加入2滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L标准HCl溶液滴定剩余的NaOH，当红色恰好消失不见的时候停止滴定，记录滴定开始和结束时酸式滴定管的刻度，计算HCl溶液消耗的体积，平行测定3组，取平均值(V)。空白组不加固定化酶而且不用在摇床上震荡，其他操作与样品组相同，记录空白组所消耗的盐酸体积数(V0)。

酶活单位定义：上述反应条件下，1 min催化β-D-葡萄糖氧化，生成1 μmol葡萄糖酸所需的酶量为一个酶活单位。

葡萄糖氧化酶酶活(EGOD)计算公式：

(1)

式中：V0为空白组消耗HCl标准溶液的体积(mL);V为样品消耗HCl标准溶液的体积(mL);c为HCl标准溶液的浓度(mol/L);60为反应时间(min);1 000为单位换算系数;n为液稀释倍数。

1.3.5 蛋白含量的测定

采用BCA蛋白浓度测定法，将0.5 mg/mL BSA标准蛋白按0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 20 μL加到96孔板中，随后各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，在OD562处测其吸光度，以BSA标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线。将数据经过回归处理，得出回归方程为

y=0.5433x+0.0402R2=0.9991

(2)

1.3.6 扫描电子显微镜

将干燥好的改性多孔壳聚糖微球粘附在铜台表面，喷金5 min。将样品台放置在载物台上，在扫描电子显微镜下观察各样品的表面结构，加速电压为20 kV。

1.3.7 傅里叶红外光谱仪

将Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM、PMCSM-COOH、游离GOD、游离CAT、PMCSM-COOH@GOD以及PMCSM-COOH@GOD@CAT研磨成粉末，烘干后进行检测。取适量KBr进行压片，测得背景值；之后取少量样品与KBr共混，研磨均匀并用压力机制成具有一定透光性的压片，最后在傅立叶红外光谱仪上测其红外光谱图，扫描范围设置为4 000～400 cm-1。

1.3.8 X射线衍射

将干燥好的Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM以及PMCSM-COOH分别铺平样品槽，随后分别置于在X射线衍射仪上进行测试，设置条件为40 kV，40 mA，试样扫描范围5～60°，扫描速率4°/min。

1.3.9 共固定化酶酸碱、温度稳定性的研究

分别将游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT这两组酶放入不同的pH(5.0～10.0)以及不同温度(10～60 ℃)的反应液中孵育，3 h后测其葡萄糖氧化酶酶活，平行做3组实验。

相对酶活(RE1%)计算公式：

(3)

式中，E为葡萄糖氧化酶在稳定性试验后酶活；E0为试验中葡萄糖氧化酶最高酶活。

1.3.10 共固定化酶的重复使用性及其储藏稳定性

PMCSM-COOH@GOD@CAT催化葡萄糖氧化生产葡萄糖酸，反应结束后在外部磁铁的作用下，将反应体系中的固定化酶进行回收，并用去离子水清洗数次，测其酶活，重复上述步骤，共测10次酶活，平行做3组实验。

相对酶活(RE2%)计算公式：

(4)

式中，En为每次收集后所测葡萄糖氧化酶酶活；E1为葡萄糖氧化酶初始酶活。

分别取16组GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT，放入4℃冰箱中储存30天每隔两天测一次酶活，平行做3组实验。

相对酶活(RE3%)计算公式：

(5)

式中，En为第n天葡萄糖氧化酶酶活酶活；E0为第0天葡萄糖氧化酶酶活。

2 结果与分析

2.1 多孔壳聚糖微球扫描电镜图

图2为不同放大倍数的多孔壳聚糖微球的SEM图像。由图可知，微球粒径大小在10～30 μm之间，分布较为均匀，均呈球形或椭球形。图2(b、c)可清楚观察到微球内部的多孔结构，较多空腔使微球外部呈凸起状，微球内可见错落的孔隙层和多孔壁。多孔壁的一定厚度((354.81±32.57)nm)保证了固定化酶载体材料的机械强度，为酶促反应的不断进行提供有力的机械支撑。大小毗邻的孔洞提高了微球的比表面积，可为更多酶的附着提供位点，该多孔壳聚糖微球具备较好的固定化酶载体特性。

图2 多孔壳聚糖微球扫描电镜图 Fig 2 SEM of porous chitosan microspheres

2.2 PMCSM-COOH的傅里叶红外光谱分析

图3是Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM与PMCSM-COOH的红外光谱图。如图所示，Fe3O4在582 cm-1处存在很强的特征峰为强吸收峰。3 432 cm-1处是壳聚糖微球的-OH振动吸收峰，2 924与2 857 cm-1处是脂肪族-C-H振动峰。1 642 cm-1处出现了明显的Schiff碱的特征吸收峰，是由C=N基团的伸展造成的，说明戊二醛与-NH2发生了反应[30]。1375 cm-1处是CH3的C-H变形振动峰，这是因为壳聚糖没有完全去乙酰基所致。1 549 cm-1处是壳聚糖微球的—N—H振动吸收峰，PMCSM-COOH在1 549 cm-1处的吸收峰强度增大且在1 415 cm-1处出现了新的特征峰，此处为—COO—的对称伸缩振动吸收带[31-32]，这说明羧基成功修饰在了壳聚糖微球上。由图可知，羧基基团的出现并没有使体系中原本的氨基基团减少，反而氨基的吸收峰强度增大，这可能是因为壳聚糖微球上的—OH发生反应转化为—NH2后只有部分被修饰为—COOH，这些结果表明本文所制得的羧基改性壳聚糖微球较未改性前拥有更多的活性官能团，可参与GOD与CAT的固定化。

图3 Fe3O4、CS、PCSM、PMCSM与PMCSM-COOH的红外光谱图Fig 3 FT-IR spectra of Fe3O4, CS, PCSM, PMCSM and PMCSM-COOH

2.3 PMCSM-COOH的X-射线衍射分析

图4是Fe3O4、CS粉末、PCSM、PMCSM与PMCSM-COOH的XRD图。如图所示，CS粉末在2θ=19.2°和28.4°处显示出2个衍射峰，分别对应于壳聚糖(110)和(130)晶面。PCSM中(130)晶面衍射峰消失，表面壳聚糖在再生过程中分子链发生重构。同时，MCSM在2θ=30.9°、36.2°、43.8°和57.7°处显示出4个不同的峰，分别为Fe3O4在(220)、(400)、(422)和(511)处的晶面衍射峰。这些结果表明，多孔磁性壳聚糖微球的成功制备。PMCSM-COOH主要衍射峰的位置与PMCSM主要衍射峰的位置是一致的，这说明改性后的磁性壳聚糖微球晶体结构没有发生显著改变[31]。通过FT-IR与XRD的结构分析表明，本文成功制备得到羧基修饰的磁性壳聚糖微球。

图4 Fe3O4、CS、PCSM、PMCSM与PMCSM-COOH的X射线衍射图Fig 4 XRD patterns of Fe3O4, CS, PCSM, PMCSM and PMCSM-COOH

2.4 GOD与CAT的添加量对GOD酶活的影响

在固定化酶的过程中，酶与载体的相对用量对其相对酶活有一定的影响。在材料的用量一定时，酶的装载量过多会导致酶的聚集，从而产生较大的空间位阻，这会在很大程度上降低其相对酶活，影响催化效果；相反，当酶的添加量过少时会导致有些材料没有载酶，造成材料的浪费。本文采用GOD与CAT这一经典的级联催化反应，旨在进一步提高GOD的催化活性，因此本文通过检测GOD的相对酶活来评估二者的相对用量对固定化酶的酶活影响，如下图5、6所示。在PMCSM-COOH用量一定时，为研究GOD的最适添加量，探讨了PMCSM-COOH@GOD的相对酶活与载蛋白量随着GOD用量增加而变化的情况。其中，GOD酶液浓度为8.72 mg/mL，相对酶活是指PMCSM-COOH@GOD酶活与其固定在PMCSM上同等数量游离GOD所对应的酶活之比。如图5所示，随着GOD用量的增加，PMCSM-COOH的载GOD量随之增加，在GOD用量达到1.2 mL(10.46 mg)之后，载GOD量稍有下降，这可能是因为过多的酶分子之间发生交联聚集，并未固定在载体上。此时PMCSM-COOH@GOD相对酶活变化不大，甚至有些许的下降，这可能是因为PMCSM-COOH载蛋白能力达到饱和状态，GOD用量过多会导致酶的聚集，产生较大的空间位阻，影响底物传递效率。因此，在接下来的实验中选择PMCSM/GOD质量比为100/9.34为最适比例来固定GOD，此时，PMCSM@GOD载GOD量为(93.43±1.12 )mg/g，是未改性之前的1.55倍，相对酶活为(90.09±1.29)%，与未改性之前相比差异不大，表明在大幅度提高载酶量的同时，并没有因团聚现象或传质阻力等问题而降低固定化酶的相对酶活，即羧基修饰后确实提高了壳聚糖微球的有效载酶容量。

图5 GOD添加量对GOD的相对酶活与载GOD量的影响Fig 5 Influence of the amount of GOD on the relative enzyme activity and protein loading of GOD

图6是在上述GOD与PMCSM-COOH最适比例条件下，PMCSM-COOH@GOD@CAT相对酶活随着CAT用量增加而变化的曲线。其中，CAT酶液浓度为11.25 mg/mL，相对酶活是指PMCSM@GOD@CAT中GOD酶活与其固定在PMCSM上同等数量游离GOD所对应的酶活之比。如图6所示，随着CAT的加入，PMCSM@GOD@CAT相对酶活有明显的提升，CAT的共固定化及时清除了有害副产物H2O2，防止由于H2O2的氧化作用而引起的GOD失活，此外CAT分解H2O2产生的O2可以被GOD再次利用，这在一定程度上提高了PMCSM-COOH@GOD@CAT的活性。CAT用量超过1.0 mL(11.25 mg)之后，其相对酶活稍有下降，这可能是因为过多的CAT占据体系中更多的空间，酶的活性位点被遮蔽。综上，本实验选择PMCSM-COOH/GOD/CAT质量比为100/9.34/10.78为最佳比例来制备固定化酶，此时，PMCSM-COOH@GOD@CAT相对酶活为(131.91±0.58)%，与PMCSM@GOD相比提高了1.46倍。

2.5 PMCSM-COOH@GOD@CAT的温度稳定性

为了研究温度对固定化酶稳定性的影响，测试了它们在不同温度下的催化活性，图7是游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT在10～60 ℃温度下孵育3 h后的相对酶活，相对酶活是指酶在不同温度下孵育3 h后的酶活与最高酶活之比。如图所示，固定化酶在40 ℃下孵育3 h后仍然具有较高的相对酶活，为(90.52±1.07)%，而游离酶相对酶活只有(74.70±0.32)%。随着温度的继续升高，游离酶与固定化酶的相对酶活之间的差异越来越显著。当温度为60 ℃时，游离酶酶活只保留了(15.13±2.39)%，大部分都已失活，而固定化酶酶活保留了(65.28±1.58)%。这可能是经过固定化之后，酶的稳定性有所增加，较高的温度为固定住的酶和底物分子提供一定的能量参与反应，因而与游离酶相比更加耐高温，这为今后在食品工业方面的发展打下了一定的基础。

图6 CAT添加量对GOD的相对酶活与载CAT量的影响Fig 6 Influence of the amount of CAT on the relative enzyme activity of GOD and protein loading of CAT

图7 游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT的温度稳定性Fig 7 Temperature stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.6 PMCSM-COOH@GOD@CAT的酸碱稳定性

为了研究pH对固定化酶稳定性的影响，测试了它们在不同pH下的催化活性，图8是游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT在pH值=5～10的条件下孵育3 h后的相对酶活，相对酶活是指酶在不同pH下孵育3 h后的酶活与最高酶活之比。如图所示，在弱酸的条件下，各组中GOD保留的酶活都相对较高，这是因为GOD的最适pH是偏酸性的，因此在弱酸的条件下，各组GOD都保持着较好的酶活，在pH值=6附近，游离GOD与固定化GOD都有着最高的相对酶活。在碱性的条件下，游离GOD失活较为严重，在pH值=10时，游离GOD相对酶活仅为(2.96±1.10)%，PMCSM-COOH@GOD@CAT的相对酶活仍有(70.72±1.73)%，这可能是游离GOD经过固定化后，其酶分子活性构象更加稳定，并且壳聚糖微球表面存在着不同电荷，这些电荷的存在使得固定化酶在碱性条件下有一定的缓冲作用，pH的变化对其影响较小。这为PMCSM-COOH@GOD@CAT的应用奠定了良好的基础。

图8 游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT的酸碱稳定性Fig 8 pH stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.7 PMCSM-COOH@GOD@CAT的重复使用性

图9是PMCSM-COOH@GOD@CAT重复催化葡萄糖氧化10次每一次对应的相对酶活，相对酶活是指每次催化氧化后的酶活与最初酶活之比。如图所示，重复使用10次后PMCSM-COOH@GOD@CAT保留着较高的相对酶活，为(79.16±1.98)%。

图9 PMCSM-COOH@GOD@CAT的重复使用性Fig 9 Reusability of PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.8 PMCSM-COOH@GOD@CAT的储藏稳定性

图10是游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT在4℃冰箱中储存，每隔两天测一次酶活，得到的相对酶活随时间变化的曲线。相对酶活是指某天的酶活与第0天酶活之比。如图所示，与游离GOD相比，固定化酶有着更好的保留原始酶活的能力。经过30的储存，PMCSM@GOD@CAT维持了最初活性的(80.41±2.49)%，而游离GOD只有(62.21±1.00)%。这可能是因为GOD经过交联后，形成了不可逆的稳健的化学结构。

图10 游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT的储藏稳定性Fig 10 Storage stability of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

2.9 PMCSM-COOH@GOD@CAT的Lineweaver-Burk动力学研究

为了研究酶与底物亲和力的关系，本实验在不同葡萄糖溶液浓度下进行了Lineweaver-Burk动力学研究，以1/V为横坐标，1/[s]为纵坐标，可绘制出一条直线，将数据经过线性回归处理，可得出回归方程，如图11所示。根据双倒数作图可得游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT的Km和Vmax，如表1所示。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Km值(572.06 mmol/L)远低于游离GOD的Km值(765 mmol/L)，说明PMCSM-COOH@GOD@CAT与底物亲和力较大。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Vmax(45.11 mmol/(L·min))高于游离GOD(37.61 mmol/(L·min))，Vmax略高的主要原因是PMCSM-COOH@GOD@CAT活性升高。PMCSM-COOH@GOD@CAT的Vmax/km值高于游离GOD的Vmax/km值，说明PMCSM-COOH@GOD@CAT容易与底物发生相互作用，表现出较高的催化效率[33-34]。

2.10 PMCSM-COOH@GOD@CAT二级结构分析

傅里叶红外光谱数据分析是测定酶二级结构的有效方法之一，酰胺Ⅰ带(1 600 ～1 700 cm-1)对酶任何二级结构变化都非常敏感，该频带中每个子分量带可代表特定的二级结构，如α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规则卷曲结构[35]。有研究表明，可通过观察红外中酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的光谱来分析酶的固定情况和活性，

表1 游离GOD与PMCSM-COOH@GOD@CAT的动力学参数Table 1 Kinetics parameters of free GOD and PMCSM-COOH@GOD@CAT

其中酰胺Ⅰ带的二级结构分析可用来确定固定化酶仍然具有活性[36]。本实验对游离GOD、PMCSM-COOH@GOD、游离CAT以及PMCSM-COOH@GOD@CAT的红外光谱进行处理，采用基线校正，Gaussian去卷积，二阶导数拟合，然后在origin软件中进行多峰拟合，根据峰面积计算各二级结构的相对含量。图12是游离GOD(a，c)与PMCSM-COOH@GOD(b，d)的FT-IR吸收光谱以及其在酰胺Ⅰ带拟合结果，1 620.02 cm-1附近归属于β-折叠，1 636 cm-1附近归属于无规则卷曲，1 649.99 cm-1附近归属于α-螺旋，1 664.40与1 681.30 cm-1附近归属于β-转角。所有样品峰值位置都在1 645 cm-1左右，据文献报道这表明酶活性得以保留，因为酶失活的最相关特征之一是酰胺Ⅰ峰值的变化[37]，这在我们的样品中没有发生。图13是游离GOD与PMCSM-COOH@GOD的二级结构相对含量。由图可知，α-螺旋和β-转角含量在二者中占主导，PMCSM-COOH@GOD的α-螺旋相对含量高于游离GOD，α-螺旋结构的构象得益于较强的氢键以及电荷相互作用，其在酶分子的刚性结构和稳定性方面起着重要作用，这一结果表明PMCSM-COOH@GOD具有更好的结构刚性，其稳定性优于游离酶[38-40]。

图12 游离GOD(a，c)与PMCSM-COOH@GOD(b，d)的FT-IR吸收光谱以及其在酰胺Ⅰ带拟合结果Fig 12 FT-IR absorption spectra and amide I fitting results of free GOD (a, c) and PMCSM-COOH@GOD (b, d)

图13 游离GOD与PMCSM-COOH@GOD的二级结构含量Fig 13 Secondary structure content of free GOD and PMCSM-COOH@GOD

为了探讨PMCSM-COOH@GOD@CAT的结构，图14研究了游离CAT(a，c)与PMCSM-COOH@GOD@CAT(b，d)的FT-IR吸收光谱及其在酰胺Ⅰ带拟合结果，二者峰值位置都在1 645cm-1左右，均保留有较好的酶活。图15是游离CAT与PMCSM-COOH@GOD@CAT的二级结构相对含量，由图可知，二者之间的二级结构相对含量稍有波动，未发生太大变化。其中，PMCSM-COOH@GOD@CAT的α-螺旋相对含量要略高于游离CAT，即CAT的固定化使其结构刚性在一定程度上得到增强，提高了酶分子的硬度与稳定性，可更好地抵抗极端反应微环境，为双酶级联反应的进行提供有力保障。

图14 游离CAT(a，c)与PMCSM-COOH@GOD@CAT(b，d)的FT-IR吸收光谱以及其在酰胺Ⅰ带拟合结果Fig 14 FT-IR absorption spectra and amide I fitting results of free CAT (a, c) and PMCSM-COOH@GOD@CAT (b, d)

图15 游离CAT与PMCSM-COOH@GOD@CAT的二级结构含量Fig 15 Secondary structure content of free CAT and PMCSM-COOH@GOD@CAT

3 结 论

成功制备了一种新型的羧基修饰的多孔磁性壳聚糖微球并对其进行相关表征。当PMCSM-COOH/GOD/CAT质量比为100/9.34/10.78时，GOD相对酶活达到最高，为(131.91±0.58)%，与PMCSM@GOD相比提高了1.46倍，且其载酶量相较于未改性前得到提高。PMCSM-COOH@GOD@CAT表现出良好的温度稳定性与pH稳定性，当温度为60℃时，游离GOD酶活只保留了(15.13±2.39)%，大部分都已失活，而PMCSM-COOH@GOD@CAT酶活保留了(65.28±1.58)%。在pH值=10时，游离GOD相对酶活仅为(2.96±1.10)%，PMCSM-COOH@GOD@CAT的相对酶活仍有(70.72±1.73)%。重复使用10次后PMCSM-COOH@GOD@CAT保留着较高的相对酶活，为(79.16±1.98)%；经过30的储存，PMCSM@GOD@CAT维持了最初活性的(80.41±2.49)%，而游离GOD只有(62.21±1.00)%。通过对游离GOD与PMCSM-COOH@GOD的FT-IR中酰胺Ⅰ带进行分析，PMCSM-COOH@GOD的α-螺旋含量高于游离GOD，即PMCSM-COOH@GOD有着更好的结构刚性以及稳定性，可体现在固定化酶比游离酶具有更好的温度稳定性与pH稳定性。同理，通过对游离CAT与PMCSM-COOH@GOD@CAT的二级结构分析，PMCSM-COOH@GOD@CAT的α-螺旋含量略高于游离CAT，固定化提高了酶分子的结构刚性及稳定性。综上所述，本文所制备得到的羧基修饰双酶共固定化体系在提高载酶量的同时仍保留有较好的催化活性和稳定性，为固定化酶在将来的化工以及食品工业应用打下一定的基础。