河南地区少见CRE耐药性分析及碳青霉烯酶初筛实验的临床应用

孙 英，李 轶，闫文娟，荆 楠，马 冰

（河南省直第三人民医院检验科，河南 郑州 450000）

近年来，极具耐药性的革兰阴性细菌，尤其是碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）的检出率日益增高[1]。2018年全国细菌耐药监测报告显示，河南地区CRE检出率居首位[2]。产碳青霉烯酶是CRE最重要的耐药机制[3]。本研究回顾性分析河南省直第三人民医院2019年少见CRE的临床检出和耐药情况，并分析CRE产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的情况，为CRE院内防控及精准治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2019年分离自河南省直第三人民医院临床样本的非重复少见CRE，从中随机选取22株亚胺培南和/或美罗培南耐药[最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]株。

1.2 仪器和试剂

美国BD公司Phoenix-100全自动细菌鉴定和药敏系统、英国OXIOD公司药物敏感性试验纸片，郑州安图生物科技有限公司血琼脂平板和M-H平板，珠海迪尔生物有限公司酶抑制剂法缓冲液试剂，NG-TEST CARBA 5胶体金试剂盒（长沙中生众捷公司），MALDI-TOF MS质谱仪（德国布鲁克公司）。

1.3 质控菌株

铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和大肠埃希菌（ATCC 25922）为体外药物敏感性试验质控菌株；肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706、ATCC BAA 2146）为碳青霉烯酶初筛实验质控菌株，由河南省人民医院闫文娟博士惠赠。

1.4 方法

1.4.1 细菌培养鉴定及体外药物敏感性试验 按照第3版《临床微生物检验标准化操作》[4]要求进行样本采集及细菌培养，采用 Phoenix-100全自动细菌鉴定和药敏系统进行菌株鉴定和体外药物敏感性试验，同时采用纸片扩散法进行补充体外药物敏感性试验，参照2018年美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S28文件[5]进行结果判读。

1.4.2 碳青霉烯酶酶型初筛实验 随机选取22株除肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌外的CRE临床分离株，采用MALDI-TOF MS质谱仪进行菌种复核，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）联合3-氨基苯硼酸（3-aminophenylboric acid，APBA）碳青霉烯酶抑制实验和胶体金免疫层析法筛查菌株产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的酶型[6]。

1.5 统计学方法

采用WHONET 5.6和EXCEL 2013软件进行统计分析。

2 结果

2.1 CRE检出情况

2019年河南省直第三人民医院共检出1 111株CRE，其中阴沟肠杆菌49株（15.4%）、产酸克雷伯菌14株（19.2%）、枸橼酸杆菌属12株（13.8%）。见表1。

表1 CRE菌种分布及构成比

2.2 CRE耐药性分析

CRE对多种临床常用抗菌药物有较高的耐药率，不同菌属对不同抗菌药物的耐药性存在差异。CRE对亚胺培南的耐药率高于美罗培南；未检出对替加环素、多黏菌素B耐药肠杆菌属、产酸克雷伯菌、枸橼酸杆菌属，对多黏菌素B及替加环素天然耐药的变形杆菌属和普罗威登斯菌属对氨曲南的耐药率分别为5.3%和14.3%。不同菌属CRE对抗菌药物的耐药率见表2。

表2 CRE对临床常用抗菌药物的耐药率 %

2.3 碳青霉烯酶初筛实验结果

从1 111株CRE中随机选取22株，同时采用EDTA联合APBA碳青霉烯酶抑制实验和胶体金免疫层析法筛查菌株所产酶的酶型。结果显示，有13株EDTA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产金属酶，胶体金免疫层析法结果显示其酶型为NDM；4株APBA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产丝氨酸酶，其中3株胶体金免疫层析法结果显示其酶型为KPC，1株阴性；2株EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产金属酶+丝氨酸酶，胶体金免疫层析法结果显示其酶型分别为KPC+IMP+NDM、KPC+NDM；3株碳青霉烯酶抑制实验未检出，其中1株胶体金免疫层析法检测结果显示酶型为OXA。部分结果见图1。

图1 部分碳青霉烯酶初筛实验结果

3 讨论

近年来，由于抗菌药物的不合理使用，CRE日益增多，其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药情况也日趋严重，给临床抗感染治疗带来极大挑战，分析细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性和碳青霉烯酶酶型是解决临床治疗CRE困境的重要途径[7]。本研究结果显示，检出的1 111株CRE中，肺炎克雷伯菌所占比例最高（51.8%），其他肠杆菌科如阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、枸橼酸杆菌属、普罗威登斯菌属中亦不断有CRE菌株检出，应引起临床重视。本研究结果显示，CRE对多种临床常用抗菌药物有较高的耐药率，且肠杆菌科细菌不同菌属对不同抗菌药物的耐药性存在差异；CRE对亚胺培南耐药率高于美罗培南，肠杆菌属、产酸克雷伯菌、枸橼酸杆菌属对替加环素、多黏菌素B均敏感。虽然CLSI提示普罗威登斯菌属可能因存在非产碳青霉烯酶机制而导致亚胺培南MIC升高，但是临床检出菌株中美罗培南耐药普罗威登斯菌属CRE亦不断出现。本研究中，对多黏菌素B和替加环素天然耐药的变形杆菌属、普罗威登斯菌属对氨曲南也有较低的耐药率，分别是5.3%和14.3%。可能与其易产金属酶而能被氨曲南抑制有关[7]。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制主要为产碳青霉烯酶、产超广谱β内酰胺酶或头孢菌素酶伴外膜蛋白缺失、外排泵系统上调等，其中最重要的耐药机制是产碳青霉烯酶。根据耐药机制研究和流行病学分析结果可知，我国CRE的主要流行株为产KPC型肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌主要流行株为NDM型[8]，有关其他菌株的研究数据相对较少，酶型筛查大多采用CLSI推荐的改良碳青霉烯类失活法（modified carbapenem inactivation method，mCIM）或联合乙二胺四乙酸-碳青霉烯类失活法（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）[9]，耗时较长。本研究随机选取22株除肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌外的少见CRE临床分离株，采用联合EDTA和APB碳青霉烯酶抑制实验，同步进行胶体金免疫层析法菌株酶型筛查，结果显示，EDTA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产金属酶13株，胶体金免疫层析法检测酶型均为NDM；APBA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产丝氨酸酶4株，胶体金免疫层析法检测3株酶型为KPC，1株阴性，推测可能产KPC和OXA外的其他丝氨酸酶；EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制实验阳性即产金属酶+丝氨酸酶2株，胶体金免疫层析法检测酶型分别为KPC+IMP+NDM和KPC+NDM；碳青霉烯酶抑制实验未检出3株，其中1株胶体金免疫层析法检测酶型为OXA，2株胶体金免疫层析法检测结果为阴性的菌株可能是由非产酶机制引起的碳青霉烯类耐药。有研究结果表明，CRE菌株中，除肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌外，其他肠杆菌科细菌酶型主要为NDM型金属酶，该酶型对头孢他啶-阿维巴坦的耐药率较高[10]。

对CRE酶型进行分析能对临床CRE精准治疗提供用药参考，因此碳青霉烯酶检测具有很好的临床价值。目前，检测碳青霉烯酶的金标准是聚合酶链反应，操作都较为繁琐，需要特殊的试剂和仪器，且对操作人员有较高的要求，在大多临床微生物实验室无法常规开展。EDTA联合APBA碳青霉烯酶抑制实验操作简便，结果易于判读；胶体金免疫层析法方便快捷，大大缩短了报告时间，可尽早为临床用药提供参考。

综上所述，CRE检出率及耐药率高是河南地区临床抗菌药物使用所面临的棘手问题，少见CRE的耐药性及其多样的酶型更增加了临床治疗的困难。CRE的耐药性和碳青霉烯酶酶型检测有着广泛的临床意义，本研究后续将进一步增加酶型检测数量，并观察临床病例感染与治疗情况，以期为CRE临床诊治和感染控制提供更精准、快捷的参考。