间接法建立上海地区新生儿G6PD筛查临界值的可行性

纪 伟，田国力，朱之星，周 卓，王燕敏，张潇分

（1.上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院新生儿筛查中心，上海 200040；2.上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院生物医学信息研究中心，上海 200040）

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD） 缺乏症为常见的X染色体连锁不完全显性遗传病，是新生儿高胆红素血症常见和重要的危险因素之一，严重者可引起新生儿胆红素脑病，影响患儿智力发育，导致严重后遗症，甚至危及生命[1]。G6PD缺乏症患儿血液中G6PD水平会显著降低，通过检测新生儿G6PD水平，可早期筛查出大部分患儿并尽早干预，最大限度地降低疾病的影响[2]。G6PD缺乏症有显著的地域分布，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）建议在男性患病率＞3%的地区常规开展产前健康教育及新生儿筛查[3-4]，但随着人口的流动，这些地区患病率也逐渐增高。从2007年起，上海地区全面开展新生儿G6PD缺乏症筛查，采用定量荧光法检测滤纸干血片中的G6PD水平，结果显示上海地区新生儿G6PD缺乏症的发病率为0.18%[5]。从2018年起，上海市儿童医院新生儿筛查中心开始采用全自动新生儿疾病筛查（genetic screening processor，GSP）系统检测G6PD，以前期临床验证阶段小样本建立的220 U/L作为临界值（Cut-off值），以G6PD＜临界值判定为筛查阳性[6]。本研究拟基于大样本数据，采用间接法建立G6PD的筛查临界值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年6月—2020年6月上海市儿童医院新生儿筛查中心行G6PD缺乏症筛查的新生儿134 747名，其中男70 310名、女64 437名，日龄为2～30 d，体质量为1 350～5 400 g，母亲孕周为33～44周。所有新生儿均于出生48 h后采用针刺足跟的方法制备滤纸干血片。

1.2 仪器与试剂

2021-0010型全自动荧光免疫分析仪GSP（美国PerkinElmer公司）及配套G6PD试剂、质控品和校准品（简称GSP系统）。室内质量控制采用Westgard多规则（13s和22s），确保质控在控。本实验室参加美国疾病预防控制中心、中国台湾预防医学会和国家卫生健康委临床检验中心组织的新生儿G6PD缺乏症筛查室间质量评价计划，成绩均合格。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件和R软件进行统计分析。采用 Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性分布分析，不同性别之间比较采用Z检验。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示。将偏态分布数据采用Box-Cox转换成近似正态分布。采用四分位间距（Turkey）法剔除±1.5倍四分位距（interquartile range，IQR）以外的数据，即离群值[7]。采用R语言basicTrendline（https：//CRAN.R-project.org/package=basicTrendline）软件包绘制累计频率分布图，对任意2点间的数据进行无限循环，循环条件设为同时满足最小残差平方和占累积分布最大百分比的线性部分，直到识别出最佳线性。

因新生儿G6PD缺乏症筛查以G6PD水平降低为异常，因此按新生儿疾病筛查指标临界值建立原则[8]，本研究以参考区间下限[单边第5百分位数值（P5）]作为筛查临界值。将筛查临界值分别与厂商声明的参考区间下限和本实验室临床验证阶段采用小样本建立的临界值作比较，计算相对偏差，并与参考变化值（reference change value，RCV）进行比较，RCV公式计算为：RCV=21/2×Z×（CVA2+CVI2）1/2，式中（CVA2+CVI2）1/2表示滤纸干血片G6PD检测的不精密度，其结果来自westgard网站（http：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）；Z表示差异的95%可能性概率值，取值为1.96。以相对偏差＜RCV为两者差异无统计学意义，相对偏差＞RCV为两者差异有统计学意义。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生儿筛查总体情况

134 747名新生儿中筛查阳性352例，采用G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶比值法或基因检测确诊G6PD缺乏症233例，其中男210例、女23例，G6PD缺乏症发病率为1∶579。

2.2 入组新生儿基本信息

Kolmogorov-Smirnov检验结果显示，G6PD数据呈偏态分布。134 747名新生儿中去除G6PD缺乏症患儿233例（0.17%）和确诊为其他遗传代谢病患儿141例（0.10%），剩余数据经Box-Cox转换成近似正态分布，然后采用Turkey法剔除离群值793个（0.59%），最终入组新生儿为133 580名。见表1。

表1 入组新生儿基本信息

2.3 采用间接法建立G6PD参考区间

Z检验结果显示，男婴与女婴之间G6PD水平差异有统计学意义（P＜0.000 1）。将男婴和女婴G6PD检测结果用Box-Cox转换成近似正态分布曲线，见图1。以累积频率作为横坐标，G6PD检测结果为纵坐标，对任意2点间数据进行无限循环拟合，得出的最佳线性曲线见图2。根据拟合线性方程，以P5为临界值，求得男婴G6PD的临界值为317.8 U/L、女婴为325.7 U/L。见表2。

图1 男婴和女婴G6PD检测结果的频率分布直方图

图2 男婴和女婴G6PD检测结果的累计频率分布曲线

表2 间接法建立的G6PD筛查临界值

2.4 根据筛查临界值计算的相对偏差与RCV的比较结果

滤纸干血片G6PD的RCV为10.26%。无论是男婴还是女婴，采用间接法建立的筛查临界值与厂商声明的参考区间下限及本实验室依据小样本建立的临界值的相对偏差均高于RCV。见表3。

表3 筛查临界值与厂商声明、小样本临界值的相对偏差及与RCV的比较结果

2.5 间接法建立的G6PD筛查临界值的验证

233例G6PD缺乏症患儿中男婴210例，G6PD水平为15.3～258.5 U/L；女婴23例，G6PD水平为24.7～312.9 U/L，均低于相应临界值。

回顾分析2018年6月—2020年6月中国台湾预防医学会新生儿G6PD筛查院际品质保证计划的7批70份样本结果，其中阳性样本19份、阴性样本51份，以间接法建立的G6PD筛查临界值作为判断标准，阴性、阳性的符合率均为100%。见图3。

图3 室间质量评价样本检测结果

3 讨论

新生儿G6PD缺乏症筛查通过实验室方法检测滤纸干血片上G6PD浓度，把可疑患儿在新生儿期筛查出来，再进一步采用定量比值法或基因检测方法明确诊断，尽早干预，以最大限度地降低疾病对患儿的影响[9]。本研究采用GSP系统对上海地区出生的134 747名新生儿进行G6PD缺乏症筛查，确诊233例患儿，得出上海地区G6PD缺乏症的发病率为1∶579，与采用定量荧光法得出的上海地区发病率[10]基本一致。G6PD缺乏症为X染色体连锁不完全显性遗传病，男性患儿为酶活性显著缺乏的半合子，女性患儿杂合子可表现为G6PD活性接近正常或正常。本研究确诊男婴210例、女婴23例，男婴例数远高于女婴。由于以G6PD为指标的新生儿筛查是筛查有“表现型”的G6PD缺乏症[11]，因此女婴的实际发病率可能更高。

临界值是指某被测物在健康人群中的上限值或下限值，用于判断罹患疾病的风险，也是新生儿筛查工作中疾病诊断和治疗的重要依据，临界值是否准确直接影响着新生儿筛查实验室的工作质量。新生儿筛查实验室一般先建立健康新生儿中相应指标的参考区间，然后根据筛查疾病的特点，将参考区间的下限或上限定义为临界值[12]。G6PD缺乏症患儿血G6PD水平降低，故新生儿G6PD缺乏症的筛查是以G6PD低于临界值为阳性。如果临界值设定偏低，易导致假阴性，直接导致漏诊；如果设置偏高，易导致过多假阳性，造成人力、物力的极大浪费。2015年，我国国家卫生健康委临床检验中心对全国88家开展G6PD缺乏症筛查的临床实验室的调查结果显示，G6PD临界值为2.0～10.0 U/g Hb，是以每克血红蛋白中G6PD的含量为单位[13]。从2017年起，具有洗脱控制环节的GSP系统逐步被应用于临床，其G6PD的单位为U/L，直接反映了全血中G6PD的活性，特别是对于贫血等低色素新生儿，准确度更高[6]。2020年，中国台湾预防医学会的新生儿G6PD缺乏症筛查室间质量评价计划结果显示，全球参加该计划的57家筛查中心中，有11家使用GSP系统检测，其临界值为160～360 U/L。本研究采用间接法计算出的G6PD筛查临界值为男婴317.8 U/L、女婴325.7 U/L。回顾性分析233例G6PD缺乏症患儿和70份室间质量评价样本，依据此筛查临界值能检出所有患儿，且室间质量评价阴性、阳性符合率均达100%。

传统的直接法建立参考区间需要从健康人群中筛选出符合要求的参考个体，遗传代谢病的患病率较低，计算相关指标临界值至少需要10 000名新生儿，且随着检测数据的积累，需要不断修正临界值[14]，这对新生儿筛查实验室的人力和物力是一个极大的考验。另外，对在出生48 h就采集样本的新生儿疾病筛查，很多疾病还未表现出来，难以保证全部为健康人群，这使得筛选参考个体变得异常困难。本实验室早期采用直接法建立临界值，入组的28例阳性样本和75例阴性样本均经基因检测明确诊断，检测成本高，入组数量有限，难以在临床推广[6]。因此，很多新生儿筛查实验室直接引用试剂厂商或其他实验室建立的参考区间，但因人群、地域和检测系统的差异，会产生过多的假阳性和假阴性，甚至出现漏诊，直接影响新生儿疾病筛查的效率。间接法[15]是利用实验室数据库中已有的数据，以数学统计模型为基础建立参考区间的方法，既可以获得与直接法近似的结果，也避免了直接法的繁琐过程，在成本效益方面远优于直接法。美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010年发布的EP28-A3C文件[16]中允许实验室通过间接法来建立参考区间。但将间接法用于新生儿疾病筛查项目参考区间的建立，同时建立筛查临界值尚未见报道。本研究结果显示，男婴与女婴之间G6PD水平差异有统计学意义（P＜0.000 1），采用间接法建立的筛查临界值高于厂商声明的参考区间下限及本实验室依据小样本建立的临界值。这进一步说明每个新生儿筛查实验室均应自行建立相关筛查项目的参考区间和筛查临界值，且随着筛查量的增加，临界值需不断修正。本研究基于133 580名新生儿的G6PD检测数据，采用间接法建立的G6PD临界值为：男婴317.8 U/L、女婴325.7 U/L。虽然会增加一定的假阳性率，但能避免漏诊现象的发生。确诊病例和第三方室间质量评价机构结果的回顾性分析均确认了该筛查临界值用于临床G6PD缺乏症筛查的可行性。

综上所述，新生儿疾病筛查信息系统中存储着大量的检测数据，基于现有的大样本量数据，采用间接法建立G6PD的参考区间和筛查临界值，可为提高新生儿G6PD缺乏症的筛查效率提供一种切实、有效的方法，具有临床推广价值。