外周血清UBE2Q1基因甲基化状态在肾透明细胞癌中的临床价值

胡 娜，解现慈2，张 磊2，柏 平，刘琳琳，来卫东

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2山东医学高等专科学校附属医院)

肾透明细胞癌(Renal clear cell carcinoma，RCC)是最常见的一类肾细胞癌，靶向药物被证明可延长晚期患者的生存与预后，但中位生存期仍少于3年。研究肾癌的早期诊断标志物和新的治疗靶点仍具有挑战性。DNA甲基化作为表观遗传中的重要组成内容，是肿瘤发生的早期分子事件，基因启动子区高甲基化或低甲基化是肿瘤发生早期的一个高度灵敏的肿瘤生物标志物[1]。泛素结合酶E2是泛素-蛋白酶体系统中的重要组成成员，在调控细胞周期、促进肿瘤细胞的形成及分化等方面都发挥着重要的作用[1]。本研究主要探讨RCC患者外周血清泛素结合酶UBE2Q1基因启动子甲基化状态及临床意义。

1 资料和方法

1.1一般资料 选取2020年1月—2021年7月在山东医专附属医院确诊的60例RCC患者为实验组，其中男36例，女24例，平均年龄(57.28±17.22)岁。纳入标准：初次发现肾癌；未合并其他部位肿瘤；影像学检查诊断为肾脏恶性肿瘤，组织病理学诊断为RCC；未接受任何形式的抗肿瘤治疗。参照2018年美国癌症联合委员会(AJCC)肾癌TNM分期：Ⅰ期34例、Ⅱ期19例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例。参照2016版WHO/ISUP(WHO/国际泌尿病理学会)分级[2]：G1 15例、G2 28例、G3 11例、G4 6例。另选取同期健康志愿者20例为对照组，其中男12例，女8例，平均年龄(56.82±16.90)岁。本研究已通过医院伦理委员会审批，所有入组人员均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取及单个核细胞分离 两组均在空腹状态下取外周静脉血5 ml，3000 r/min离心5 min，取上层清液2 mL置于EP管中，根据QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，Germany)试剂盒操作说明书提取血清DNA；剩余血细胞样品通过Ficoll-Paque密度梯度离心法进行单个核细胞(PBMCs)的分离。提取的DNA及PBMCs均-80℃超低温冰箱保存备用。严格参照Zymo Research EZ DNA Methylation-GoldTM Kit试剂盒说明进行，先配置Conversion Reagent溶液及M-Wash Buffer溶液，对提取的DNA进行亚硫酸盐修饰。

1.2.2甲基化特异性PCR 甲基化特异性PCR反应体系：无核酶水9.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Taq Premix 12.5 μL，DNA模板2 μL，充分混匀后以4000 r/min离心5 s。扩増条件：95℃运行5 min预变性，95℃运行45 s变性、58℃运行45 s退火，72℃运行60 s引物延伸，连续进行45个循环，循环完毕后在72℃运行10 min延伸，4℃保温。反应结束后取5 μL产物，用2%琼脂糖凝胶电泳并进行图像处理。结果判断：甲基化特异引物(M)扩增出目的条带，而非甲基化引物(U)未扩出目的条带，为甲基化；U扩增出目的条带，而M无条带扩出，为非甲基化；两对引物均扩增出目的条带，这种情况为部分甲基化，记入甲基化。UBE2Q1甲基化特异性PCR引物序列见表1。

1.2.3UBE2Q1基因mRNA表达水平 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测。Trizol法提取PBMCs中的RNA，逆转录合成cDNA，-80℃冰箱保存备用。RT-qPCR反应体系：2×SYBR Green Premix 10μL，cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，无核酶水8 μL。反应条件：95℃、30 s预变性，95℃、5 s变性，60℃、30 s退火，72℃、30 s延伸，共循环40次；72℃、7 min终延伸。GADPH为内参基因，UBE2Q1与GADPH的PCR引物序列见表1。实验结果以UBE2Q1与GADPH的比值作统计分析。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1两组UBE2Q1基因甲基化状态比较 实验组甲基化阳性率为21.67%(13/60)，对照组为65%(13/20)。两组比较有统计学意义(χ2=12.84，P<0.01)。两组UBE2Q1基因甲基化状态代表性电泳图结果见图1。

图1 各组UBE2Q1基因甲基化状态代表性电泳图

2.2实验组UBE2Q1基因甲基化状态与临床指标的关系 不同肿瘤TNM分期患者的UBE2Q1基因甲基化率不同，二者呈负相关(r=-0.271，P=0.036)；其他均无统计学意义。见表2。

表2 实验组UBE2Q1基因甲基化与临床指标的关系[n(%)]

2.3实验组UBE2Q1基因mRNA表达水平 结果显示，肾癌患者中UBE1Q1基因非甲基化的患者mRNA的表达量为(7.40±1.11)×10-4，甲基化患者为(3.89±0.59)×10-4。二者比较有统计学意义(t=10.94，P<0.01)。

3 讨论

DNA甲基化在基因表达调控、恶性肿瘤发生等重要生物学过程中发挥重要作用。殷凤朝等[2]研究发现，SERP5基因启动子区高甲基化可能与RCC的发生、发展相关，高甲基化可能引起该蛋白表达降低。林英立等[3]研究表明，肾癌组织PCDH10甲基化阳性率较高，与肾癌的发生、发展及患者预后不良相关。

泛素-蛋白酶体系统在细胞内降解了接近80%的蛋白质，还参与细胞凋亡、细胞周期调控以及细胞内信号传导等多种生理活动过程。如果泛素-蛋白酶体系统发生异常变化，就会导致生物体出现一系列的反应，如炎症、癌症以及神经退化等。因此，该系统可作为潜在的疾病诊断干预治疗靶点。UBE2Q1属于泛素结合酶E2家族成员，可以调控底物蛋白的降解和功能转换[1]。研究显示，UBE2Q1基因异常表达与恶性肿瘤的发生发展相关，UBE2Q1基因启动子在肝癌患者外周血清中呈低甲基化表达[4-5]。

许多肿瘤患者的cfDNA中均存在异常的DNA甲基化改变[6-7]。检测外周血清cfDNA中肿瘤相关基因的甲基化状态，有助于肿瘤患者的早期诊断、预后判断。本研究显示，实验组外周血清cfDNA中UBE2Q1基因甲基化阳性率明显低于对照组，其mRNA呈现高表达。提示UBE2Q1基因的低甲基化及mRNA的高表达在肾癌的发病过程中起促进作用。有研究显示，基因的甲基化表达异常与患者肿瘤大小、分级等密切相关[8-9]。本研究分析了UBE2Q1甲基化与患者性别、年龄、肿瘤TNM分期、WHO/ISUP分级的相关性，发现RCC患者UBE2Q1甲基化率与肿瘤TNM分期具有负相关性，与其他无关。提示UBE2Q1甲基化率可用于RCC的早期诊断及预后判断。

综上所述，RCC患者外周血清cfDNA中UBE2Q1基因的低甲基化表达与其发生、发展及预后不良相关。UBE2Q1甲基化指标有可能成为RCC早期诊断与预后判断的分子标志物。