SPE净化-UPLC-MS/MS法测定食品中二氢槲皮素

公丕学，刘桂亮，廉贞霞，薛霞，王骏，刘艳明*

1. 山东省食品药品检验研究院（济南 250101）；2. 山东省特殊医学用途配方食品质量控制技术研究中心（济南 250101）；3. 山东省药学科学院（济南 250101）

二氢槲皮素（dihydroquercetin，DDQ）是一种存在于多种植物中的天然二氢黄酮醇类化合物（化学结构式见图1），在落叶松中含量较高[1-3]。近年来，在水果中也发现DDQ的存在[4-7]，特别是在葡萄、橘子和西柚中[4,6]。DDQ因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗心血管系统疾病[8-9]、改善毛细血管微循环、改善脑部血液循环、抗血小板凝聚等作用[10-11]，用于治疗脑梗及其后遗症、脑血栓、心脏冠状动脉等疾病[12-13]，因此将其开发为食品添加剂、保健食品和药品等相关产品，具有极大的研发价值和广阔的市场前景[8,10,13-14]。鉴于二氢槲皮素在婴幼儿、儿童（14岁及以下）、孕妇、哺乳期妇女人群中的食用安全性资料不足，从风险预防原则考虑，上述人群不宜食用。DDQ最大推荐食用量为100 mg/d，在食品领域中，主要是当作活性添加剂，在增加食品保质期的同时还能保留原本的味道，并且有一定预防疾病的作用。欧盟已批准落叶松来源的DDQ为新食品原料，俄罗斯已批准DDQ作为食品原料和食品添加剂使用。2020年国家卫生健康委通过DDQ作为新食品原料在饮料（20 mg/L），发酵乳和风味发酵乳（20 mg/kg），可可制品、巧克力和巧克力制品（70 mg/kg）中[15]等食品中使用并规定最大添加量，但是国内还未建立针对食品中DDQ的食品国家安全标准，因此有必要建立食品中DDQ的定量检测方法。

图1 DDQ结构式

测定DDQ的方法主要有高效液相色谱法[16-17]、荧光法[18]、液相色谱串联质谱法[5,19]及分光光度法[20]。高效液相色谱方法灵敏度低，分析时间长，降低检测效率；荧光分析方法灵敏度高，当食品基质复杂时易受干扰，定量准确性差；分光光度法存在灵敏度低，定量结果不准确等问题；液相色谱串联质谱法样品前处理步骤简单，选择性好，灵敏度高，定性定量准确。DDQ测定方法针对的基质多是水果[6]、植物[14]和中药[16]等。针对食品复杂性和多样性，通常选用的提取净化方式有超声微波法[14,21]、SPE柱净化[22-23]和QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）基质分散固相萃取[24-25]。试验选取发酵乳和可可制品国家允许添加食品基质为研究对象，对样品预处理条件和仪器条件进行优化选择。采用甲醇-2%乙酸（1∶1，V/V）混合溶剂提取，HLB SPE柱净化，高效液相色谱串联质谱法快速测定批量食品中DDQ。

试验旨在建立准确快速测定食品中DDQ含量的液相色谱串联质谱方法，为制定食品中DDQ的检测提供参考，为企业和监管部门提供行之有效的准确定性定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与装置

ACQUITYTMUPLC超高效液相色谱仪及Xevo TQ-S质谱分析仪配有电喷雾（ESI）离子源（美国Waters公司）；MS-3旋涡混合器（德国IKA公司）；超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；3-18k高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；温控氮吹仪（美国Organomation公司）。

1.2 主要材料与试剂

DDQ标准品（CAS 480-18-2，纯度＞98%，上海安谱公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈、甲酸、乙酸（色谱纯，德国Merck公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；ACQUITY UPLC HILLIC（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；Hypersil Hypercarb（3 μm，2.1 mm×100 mm，美国Thermo Scientific公司）；Bond Elut C18（C18，500 mg/6 mL，美国agilent公司）；Waters OASIS HLB（HLB，200 mg/6 mL，美国Waters公司）；Waters Oasis PRiME HLB（PRiME HLB，200 mg/6 mL，美国Waters公司）；发酵乳、可可制品（均购自当地市场）。

1.3 标准溶液配制

称取适量的DDQ标准品，用甲醇配成1 mg/mL标准物质储备液，-18 ℃保存3个月。用初始流动相乙腈-0.1%甲酸（1∶9，V/V）将DDQ储备液稀释成质量浓度为0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50和1.00 μg/mL标准系列溶液，供UPLC-MS/MS测定。

1.4 样品前处理

准确称取2.0 g样品至50 mL离心管，加入25 mL混合提取溶剂甲醇-2%乙酸（1∶1，V/V），涡旋5 min，超声提取20 min，用提取溶剂定容至50 mL，以8 000 r/min离心5 min，取5 mL清液用20 mL水稀释混合均匀后，过HLB SPE柱净化（上样前SPE柱依次用6 mL甲醇，6 mL水活化），控制流速约1.0 mL/min，上样完成后用5 mL水淋洗，8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液在45 ℃水浴中氮吹至近干，用5 mL初始流动相复溶，超声溶解5 min后，涡旋1 min后，过0.22 μm微孔有机滤膜，滤液供UPLC-MS/MS测定。

1.5 试验条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱，ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm× 100 mm）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样量1.0 μL；流动相A乙腈、B 0.1%甲酸。流动相梯度：0～2 min，10% A；2～5 min，10%～95% A；保持1 min，95% A；6～6.5 min，95%～10% A；保持1.5 min，10% A。

1.5.2 质谱条件

离子源，采用电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，采用负离子扫描；检测方式，采用MRM检测；毛细管电压2.2 kV，锥孔电压45 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，锥孔气流速150 L/h，碰撞气流速0.15 mL/min；脱溶剂气流速850 L/h。DDQ的关键质谱参数见表1所示。

表1 化合物优化的关键质谱参数

1.5.3 基质效应评价

在液相色谱质谱联用技术中基质效应（matrix effect，ME）普遍存在，主要是由于样品基质溶液中共萃取物与目标分析物在离子源上存在离子竞争效应，通常有离子增强和离子抑制两种作用[26]。不含DDQ的样品基质按样品前处理方法处理，获得空白基质溶液，用基质空白溶液稀释标准溶液，用初始流动相稀释标准溶液与空白基质溶液稀释相同浓度DDQ标准液的响应值进行比较，评估DDQ的基质效应，可通过式（1）计算。

式中：A为标准溶液中分析物的峰面积；B为样品处理液中分析物的峰面积。ME接近100%时，表现为无基质效应；大于100%时，表现为基质增强；反之，则为基质抑制。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件优化

2.1.1 提取溶剂的优化

以发酵乳和可可制品为试验对象，分别考察甲醇与2%乙酸不同比例混合提取溶剂对DDQ提取效率的影响。0，25%，40%，50%，60%，75%和100% 7种不同比例提取溶剂对不同基质的提取效率如图2所示。结果表明，不同比例提取溶剂对发酵乳提取效率接近，对可可制品中的DDQ提取效率不同。提取可可制品中DDQ时，水相比例升高时，DDQ回收率提高，水相比例达到50%时提取回收率最高，水相比例继续提高时DDQ提取效率降低。发酵乳中DDQ用不同比例提取溶剂提取时，提取效率接近，推测是因为发酵乳中蛋白含量可能由于甲醇和酸溶液的加入，致使蛋白沉淀变性，因此基质共萃取物对DDQ提取影响较小。然而可可制品基质比发酵乳基质更复杂，当用甲醇或酸溶液单独作为提取溶剂时，DDQ很难从可可制品中提取出来，但体系中甲醇和2%乙酸水同时存在时，对基质中的脂肪、蛋白质等杂质有沉淀作用，降低共萃取物的含量，从而提高对DDQ的提取效率，但甲醇-2% HAc（50%，V/V）时，提取效率最高。因此选择甲醇-2% HAc（50%，V/V）作为最优提取溶剂。

图2 提取溶剂比例对DDQ的影响

2.1.2 固相萃取柱的选择

DDQ由于结构式中含有多个羟基基团，极性较强，易溶于水，在反相色谱中不易保留。食品基质含有糖类、脂肪、蛋白质等多种杂质，为准确测定出不同食品基质中DDQ含量，要降低共萃取物的提取效率，因此试验选择通过使用固相萃取方法提高杂质去除效果，提高灵敏度。选择常用3种固相萃取柱C18、HLB、和PRiME HLB对DDQ的净化效果进行试验，结果如图3所示。使用HLB固相萃取柱时回收率最高。PRiME HLB和C18固相萃取柱回收率低于80%，比HLB固相萃取柱提取回收率低，因此选择HLB固相萃取柱用于后续试验前处理样品净化步骤中，提高分析的灵敏度和准确度。

图3 DDQ通过SPE柱的回收率

2.1.3 稀释比例的优化

上样溶液的有机相比例对化合物在HLB柱上保留效果有影响，提取溶液甲醇含量为50%，试验用水按照0，1，2，3，4，5和6的不同稀释比例将样品提取溶液进行稀释后上柱试验，结果如图4所示。比例低于4时，DDQ回收率低于80%，可能是由于低稀释比例时甲醇含量高，不利于DDQ在固相萃取柱上保留，因此回收率偏低。稀释比例为4时，DDQ回收率约95%，稀释比例继续增大时，回收率几乎不变，但是上样时间增长，不利于提高试验效率。说明稀释比例大于4时（稀释比例为4时，甲醇比例为10%），DDQ能够较好地吸附于HLB柱上，不会在上样时因甲醇比例过高而损失。按照稀释比例大于4时，甲醇含量在10%以下，目标化合物能在SPE上很好保留。因此将提取溶液与水按照1∶4（V/V）稀释后进行固相萃取富集净化，DDQ能够吸附在固相萃取柱上不会损失。

图4 提取液稀释倍数在SPE柱上的回收率

2.1.4 洗脱体积的优化

在固相萃取净化洗脱过程中，洗脱液体积以能够完全洗脱最小体积为前提，根据DDQ回收率变化选择最合适的洗脱液体积，洗脱液体积越小时，洗脱杂质越少，但是同时DDQ在固相萃取柱上保留需要进一步考察。试验发现使用不同体积甲醇对DDQ洗脱时对目标物洗脱有影响。选择甲醇体积0.5，1.0，2.0，5.0，8.0和10.0 mL进行考察，洗脱曲线如图5所示。甲醇体积小于8 mL时，DDQ回收率随甲醇体积增大而提高。体积8 mL时回收率达到90%左右，甲醇体积继续增大时，回收率几乎不变，说明DDQ几乎完全从固相萃取柱上洗脱下来。但是增大甲醇体积，则会延长氮吹浓缩时间，降低试验效率，同时会造成资源浪费和环境污染。综合考虑，选择洗脱液甲醇体积为8 mL。

图5 洗脱体积对DDQ提取的影响

2.2 色谱条件的优化

从DDQ结构可以看出，不适合亲水色谱柱分离分析，因此选择使用反相色谱柱进行分析。在反相色谱柱上目标物的保留时间适宜，峰形更好，但是DDQ在BEH C18色谱柱上有拖尾和色谱峰展宽现象，同时DDQ响应值变低。HSS T3色谱柱在分离DDQ时有更好的峰形，响应值更高，因此采用HSS T3色谱柱进行分析检测。

流动相的酸碱性会影响DDQ离子化效率，同时也会影响液相色谱峰峰形，试验比较中性流动相（A乙腈-10 mmol/L乙酸铵）、碱性流动相（B乙腈-0.1%氨水（V/V））、酸性流动相（C乙腈-0.1%甲酸（V/V））3种不同pH流动相体系。在相同分离程序下，考察DDQ峰形及响应情况，试验结果如图6所示。在流动相B条件下的DDQ峰形要比其他2种流动相的峰形差，A和B峰形都很好，但是流动相A条件的质谱信号响应值低于流动相C条件，说明在流动相C条件下离子化效率比在流动相A条件下要高。因此选择乙腈-0.1%甲酸作为流动相，色谱峰峰形好，灵敏度高。

图6 DDQ在不同流动相的总离子流图（TIC）

2.3 质谱条件的优化

质谱试验中通常选用ESI和APCI这2种电离方式，根据结构可以分析DDQ属于极性较强的化合物，由于APCI电离方式适合检测中等极性或者弱极性的化合物，因此选择ESI电离方式更适合DDQ的检测。

将质量浓度100 ng/mL的DDQ标准溶液注入三重四级杆质谱仪，分别在正负模式下进行母离子扫描，发现在负离子模式下响应强，通过结构分析，可能是因为DDQ含有易失去氢的羟基基团，使得在ESI-模式下进行母离子扫描，确定其准分子离子峰丰度最大条件，得到母离子质核比为303；调节质谱参数后进行子离子扫描，进一步优化碰撞电压等质谱参数，选择2个丰度较高的子离子，以丰度相对高的子离子303＞285作为定量离子，以丰度相对较低的子离子303＞125作为辅助定性离子，最终得到优化参数见1.5.2中表1所示。

2.4 基质效应评价分析

通过评估DDQ在不同食品基质中的基质效应，选择合适的定量方式，在不含DDQ的处理溶液中加入与标准溶液相同浓度的标准物质。通过式（1）进行基质效应计算，当基质效应接近100%时，表现为无基质效应；大于100%时，表现为基质增强；反之，则为基质抑制。评价DDQ质量浓度10，50，100，500和1 000 ng/mL在发酵乳和可可制品基质中的基质效应，结果如图7所示。DDQ在发酵乳基质中表现为基质增强效应，可可制品中为基质抑制效应。质量浓度10 ng/mL时，基质效应明显，但质量浓度50 ng/mL以上时不同基质的基质效应变化不大，发酵乳为基质增强，可可制品则为基质抑制，因此DDQ浓度低时，受样品基质影响较大，质量浓度大于50 ng/mL时，不同基质对不同浓度DDQ素影响不大，但定量结果也存在偏差，仍存在较强基质效应，不适合直接用标准溶液进行定量，因此选择空白基质稀释标准溶液外标法定量方式。

图7 DDQ在不同基质中的基质效应

2.5 方法线性范围和检出限

用空白基质稀释流动相将DDQ储备液逐级稀释得到质量浓度为10，50，100，200，500和1 000 ng/mL的系列标准溶液。将系列标准工作液按浓度从低到高的顺序，按1.5试验条件进行测定，以DDQ峰面积（y）为纵坐标对质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。DDQ在10～1 000 ng/mL之间线性关系良好，线性回归方程为y=1 516.9x+443.2，线性相关系数为0.999 3，以信噪比约为3时计算得到DDQ的检出限为0.040 mg/kg，以信噪比约为10时计算得到DDQ的定量限为0.125 mg/kg，样品含量超过线性范围时，需要稀释到线性范围内进行定量。

2.6 方法的回收率和精密度

以发酵乳和可可制品样品为研究对象，进行添加回收率和精密度试验。分别添加3个浓度水平，按照建立的试验方法进行处理，每个添加水平平行测定6次，回收率和相对标准偏差计算结果见表2所示。DDQ平均回收率在87.2%～98.6%，测定结果表明相对标准偏差（RSD）为1.2%～4.3%。

表2 添加回收率与精密度（n=6）

2.7 实际样品测定

用试验建立的方法对市场上购买的20批次发酵乳和10批次可可制品进行DDQ检测，检测结果均为未检出。可能由于在国内刚批准DDQ作为新食品原料在食品中添加使用，食品生产企业还没有在食品中添加DDQ，所以样品中都没有检出。

3 结论

通过对提取、净化及流动相选择等因素进行优化，建立适用于食品中DDQ的液相色谱串联质谱定性定量检测方法。针对不同食品基质，选择提取溶剂，提高提取效率；优化固相萃取方法，提高净化效果，提高方法的准确性及灵敏度；同时对DDQ在不同食品中的基质效应进行评价，选择合适的定量方式。该方法线性范围宽，灵敏度高、准确性好，适用于不同食品基质中DDQ的定性确证与定量检测，可为标准制定和政府监管提供技术支持和数据积累。