茼蒿多酚超声辅助提取工艺及其抗氧化活性
2022-03-09王小云李卓卓荣志江于佳刘仙俊孙红艳
王小云，李卓卓，荣志江，于佳，刘仙俊，孙红艳*
1. 山西农业大学 水土保持科学研究所（太原 030045）；2. 太原科技大学 化学与生物工程学院（太原 030024）
茼蒿（Chrysanthemum coronariumL.）又名蓬蒿，是我国饭桌上常见的绿叶蔬菜之一，同时也具备较高的营养价值和药用价值；茼蒿含有丰富的维生素、氨基酸、蛋白质和生物碱，可起到降血压、抗肿瘤、养心安神等作用[1]。近年来研究表明，茼蒿不同部位粗提物对西瓜枯萎病菌具有较好的抑制作用，其中茎叶抑菌效果较强[2-3]。
多酚类和黄酮类化合物是蔬菜中广泛存在的植物次级代谢产物，也是茼蒿的主要活性成分，并具有多种生物活性[4-5]。张禄捷等[6]研究表明工艺优化后的茼蒿叶片总黄酮对卵黄脂蛋白具有抑制作用，并具有较高的总抗氧化活性、羟自由基和DPPH自由基的清除作用。清除活性氧研究显示，茼蒿籽中多酚类化合物能够有效地减少活性氧对细胞的损害[7]。目前，植物多酚已经被广泛应用于食品、药品、生活用品以及养生保健品等相关领域，但大多数植物多酚的提取是采用短时高效的超声波或微波等辅助[8-9]，用水溶液、酮类或者醇类作为提取溶剂[10]，因酮类有毒性且不安全，故试验采用乙醇做提取剂，在超声波辅助下用单因素试验结合正交试验的方法对茼蒿嫩叶多酚的提取工艺进行优化。另外，由于茼蒿具有以上诸多药用价值，而生物活性是许多药用植物具有的特性，故试验也测定了优化后的茼蒿多酚总抗氧化活性、羟自由基的清除能力，试验结果有利于深入研究开发茼蒿在食品、医药等领域的应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂及仪器
茼蒿嫩叶，采购自太原市蔬菜市场；将茼蒿洗净后取下嫩叶，置于电热鼓风干燥箱中65 ℃干燥2 d后将其取出，用磨粉机粉碎过三号筛（直径200 mm，筛孔50目），密封后备用。
硫酸、盐酸、无水乙醇、磷酸盐缓冲液、碳酸钠、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、福林-酚试剂、TPTZ试剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；多酚标准品没食子酸（国家标准物质网）。
1.2 试验仪器与设备
HH-ZK2恒温水浴锅（上海一科仪器有限公司）；梅特勒XP205电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；UV8000紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱101-4A（北京科伟永兴仪器有限公司）；DS-8510DT超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）；QE-100高速粉碎机（苏州威尔实验用品有限公司）；3K30高速冷冻台式离心机（德国SIGMA公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 茼蒿多酚提取方法
多酚提取参照孙红艳等[11]的方法。称取一定量已处理的新鲜茼蒿嫩叶置于锥形瓶中，加入适量的提取剂，用封瓶膜封口，于250 W超声提取一定的时间，按8 500 r/min离心分离15 min，上清液即为茼蒿嫩叶多酚提取液。
1.3.2 茼蒿多酚含量的测定[12]
茼蒿多酚含量采用Folin-Ciocaltean法测定，取0.1 mL茼蒿多酚提取液，加入1 mL福林酚试剂，摇匀后加入2 mL 12%的Na2CO3溶液，用水定容至25 mL，摇匀，室温避光反应2 h，在765 nm波长下测其吸光度，用没食子酸做标准品、绘制标准曲线，计算多酚含量。
1.3.3 超声波法辅助提取茼蒿多酚条件优化
1.3.3.1 单因素试验设计
在预试验的基础上，固定称取茼蒿嫩叶干粉1 g，乙醇体积分数70%、液料比15∶1 mL/g、超声波提取70 min，分别将乙醇体积分数（50%，60%，70%，80%和90%）、提取时间（20，40，60，80和100 min）、液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1 mL/g）按照上述茼蒿多酚提取流程进行单因素筛选试验，考察各因素对茼蒿多酚提取率的影响。
1.3.3.2 正交试验设计
在单因素试验的基础上，进行正交试验，具体试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平设置
1.3.4 茼蒿多酚抗氧化活性分析
1.3.4.1 总抗氧化活性
茼蒿多酚总抗氧化活性以铁离子还原力表示，按照FRAP法[13]略做修改。取0.3 mL提取液，加2.7 mL FRAP工作液[20 mmol/L三氯化铁溶液、300 mmol/L醋酸钠缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液按1∶10∶1（V/V）配制，预热至37 ℃待用]，摇匀、静置10 min，593 nm 处测定其吸光度。以硫酸亚铁为标样绘制标准曲线，计算样品FRAP值，单位为μmol/L。
1.3.4.2 羟基自由基（·OH）清除能力
·OH清除能力采用邻二氮菲法测定，取2 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶于试管中，加入2 mL 150 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS），混匀，加2 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁，再次混匀，加1 mL 0.01%的H2O2，用蒸馏水定容至10 mL，混匀作损伤管，37 ℃下温育60 min，536 nm处测其吸光度AP；未损伤管中不加H2O2，用1 mL蒸馏水代替（其余药品添加同AP），测得吸光度AB；测定管加入0.5 mL待测液，测得吸光度AS。·OH自由基清除率（d）按式（1）计算。
式中：AP为损伤管的吸光度；AB为未损伤管的吸光度；AS为茼蒿多酚提取液样品管的吸光度。
2 结果与分析
2.1 不同因素对茼蒿多酚提取率的影响
2.1.1 液料比对茼蒿多酚提取率的影响
随着液料比的增加，茼蒿多酚的提取率也逐渐增加，且当液料比为20∶1 mL/g时，茼蒿多酚提取率达到最大，之后呈现下降的趋势（图1）。其原因可能为溶剂越多，超声波对单位体积物料的提取作用越小[14]。综合提取因素，为充分提取茼蒿多酚并尽量减少药品消耗，将正交试验料液比筛选范围选为15∶1，20∶1和25∶1 mL/g三个水平。
图1 液料比对多酚提取率的影响
2.1.2 提取时间对茼蒿多酚提取率的影响
随着提取时间的增加，茼蒿多酚的提取率增加，当提取时间达到60 min时提取率达最高值，超过60 min后，提取率不再明显增加，甚至有所下降的趋势（图2）。其原因可能为提取时间过短会出现提取不充分，提取时间过长则会使多酚结构发生变化，出现降解，因此将正交试验提取时间筛选范围选为60，80和100 min。
图2 提取时间对多酚提取率的影响
2.1.3 乙醇体积分数对茼蒿多酚提取率的影响
茼蒿多酚的提取率随着乙醇体积分数的增加而增加，但增加幅度较液料比和提取时间均小很多，且当乙醇体积分数为80%时茼蒿多酚提取率达最大值13.1，之后随着乙醇体积分数增大，茼蒿多酚提取率显著下降（图3）；其原因可能为乙醇和水的极性不同，适宜的乙醇体积分数会提高提取率，而当乙醇体积分数过高时，则会溶出醇溶性杂质与亲脂性强的成分，从而导致提取率降低[15]，故将正交试验乙醇体积分数筛选范围选为70%，80%和90%。
图3 乙醇体积分数对多酚提取率的影响
2.2 茼蒿多酚最佳提取工艺
在单因素试验的基础上，分别取茼蒿嫩叶1.00 g，以液料比、超声时间和乙醇体积百分数为试验因素进行三因素三水平正交试验，具体因素与设计见表1。
正交试验结果见表2，试验的三个因素中影响茼蒿多酚提取率的因素为B＞A＞C，即提取时间对茼蒿多酚提取率的影响最大，液料比次之，乙醇体积分数对茼蒿多酚提取率的影响最小；同时，综合k值及比较发现，得出茼蒿多酚提取的最佳工艺条件为6号试验：在组合B3A2C1条件下，以20∶1 mL/g的液料比，用体积分数为70%的乙醇，超声提取100 min所得的茼蒿提取率最高，可达16.015 mg/g。试验表明，可以通过正交试验优化多酚提取工艺，提取效率高且具有较好的稳定性。
表2 正交试验结果
2.3 茼蒿多酚抗氧化性分析
为了检测最佳工艺条件下提取的茼蒿多酚抗氧化活性，试验分别测定了其总抗氧化活性及羟自由基清除能力，结果表明最优条件下提取的茼蒿多酚提取液总抗氧化活性（FRAP）值为664 μmol/L，·OH自由基清除率为23.1%，表明茼蒿多酚具有一定的抗氧化活性。
3 结论
试验采用超声波辅助法对茼蒿叶片中多酚进行提取，通过单因素试验探索了料液比、提取时间、乙醇体积分数三个因素对茼蒿多酚提取率的影响，接着用正交试验进一步优化其提取工艺，得出的最佳提取条件是：液料比20∶1 mL/g、提取时间100 min、乙醇体积分数70%，此条件下的茼蒿多酚提取率达16.015 mg/g，并得到影响茼蒿多酚提取工艺的因素主次顺序为提取时间＞液料比＞乙醇体积分数。同时，将在最优条件下提取的茼蒿多酚提取液进行总抗氧化活性和羟基自由基清除能力测定，结果表明茼蒿多酚的FRAP值为664 μmol/L，茼蒿多酚的自由基清除率为23.1%，说明此茼蒿多酚类物质表现出较好的抗氧化活性，有一定自由基的清除能力。
