针刺干预对绝经后骨质疏松症模型大鼠肠道菌群影响的研究

张楚穹 石娜 欧阳钢

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一种严重危害中老年女性身心健康的常见病和多发病[1]，针灸治疗有良好的效果，但针灸起效的机制目前仍未完全明了。近年来,随着高通量测序技术的不断普及和应用，有关肠道菌群与骨代谢的关系越来越引起人们的关注，并成为近年来研究的热点[2]。已有研究证实，雌激素的缺乏可通过影响PMOP病人肠道菌群的结构及丰度，进而影响骨代谢[3]。我们的前期研究证实针灸可以通过提高雌激素的水平达到抗骨质疏松症的目的[4]，为此，我们开展了针刺干预对PMOP模型大鼠肠道菌群影响的研究，旨在探讨针灸治疗骨质疏松症的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取3月龄雌性SD大鼠32只，体质量180～220 g，未曾交配，购于南京青龙山动物中心 [清洁级，许可证号：SYXX(苏)2018-0049]。环境温度21～25 ℃，相对湿度40%～60%，光照时间每日12 h，大鼠可自由摄食、饮水。适应性饲养1周后，随机分为空白组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)和电针组(D组)，每组8只。造模期间、干预治疗阶段大鼠皆自由饮食。本研究通过南京中医药大学动物伦理学会的认证和许可(许可批号:201812A023)，实验全过程严格遵循2006年9月发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 主要试剂及仪器 DNA Marker(北京天根生化科技有限公司，M2202)，PCR预混合MIX(北京天根生化科技有限公司N2728)，Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit (美国Thermo Fisher Scientific00306196)，SYBR© Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(大连宝生物科技有限公司A650t-1)，一次性无菌针灸针(无锡佳健医疗器械股份有限公司0.20 mm×25 mm)，韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司 HANS-200A)，骨密度检测仪(法国MEDILINK MEDIX 90)，分析天平(北京塞多利斯科仪器有限公司BSA124S)，精准电子秤(南京迈博生物科技有限公司MT457A)，Phusion© High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(英国New England Biolabs)。

1.3 去卵巢(OVX)大鼠模型的建立 取模型组、电针组大鼠，用3%戊巴比妥钠(按0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，取背侧改良切口，切口位于最下肋下缘一横指，腰椎旁开一个半横指位置，二者交点为切口中心，纵行切开0.8～1 cm，于深部脂肪层中可发现粉红色卵巢，子宫角处结扎后切除卵巢[5]。以手术后连续5 d阴道涂片检查未见成熟脱落上皮细胞为造模成功指标。假手术组仅切除周围少量脂肪组织，逐层缝合；空白组不进行任何处理。

1.4 电针治疗方法 针刺组：造模2周后，不予大鼠麻醉处理，将大鼠装于自制锥形袋内，暴露针刺部位。取穴：(1)关元、三阴交(双)；(2)肾俞(双)、后三里(双)。每日选取其中一组穴位，两组穴位交替进行，取穴方法参照《实验针灸学》[6]。将针灸针刺入穴位后，接电针仪，刺激强度为2 mA，频率2 Hz/15 Hz，每次20 min，每日1次，每周连续治疗5 d，间隔2 d，共治疗12周。空白组、假手术组以及模型组仅常规饲养，不予特殊处理。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 骨密度检测：用3 %戊巴比妥钠(按0.1 mL/100 g)经大鼠腹腔注射麻醉后，将大鼠腹主动脉放血后处死，统一取右侧胫骨、股骨，剔除组织后用PBS冲洗，再用骨密度仪逐一扫描，测出胫骨、股骨的骨密度。

1.5.2 16S rDNA扩增子测序：将收集的大鼠粪便进行预处理后，采用SDS方法提取样本的基因组DNA，并检测其浓度和纯度，然后使用稀释后的基因组DNA为模板，以细菌正向引物341F和反向引物805R对细菌16S rRNA 基因V3-V4区进行PCR扩增，扩增产物经2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后使用illumina平台测序(天根生化科技有限公司)，所得序列使用Uclust v1.2.22软件进行聚类得到分类操作单元(Operational Taxonomic Units，OTU)[7]。在菌群OTU水平上计算Shannon和Simpson指数来评估菌群的多样性，同时对物种丰度进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)及分类注释。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度比较 12周后，A组与B组比较，骨密度值差异无统计学意义(P>0.05)，C组与A组、B组比较，骨密度值明显降低(P<0.05)，提示造模成功；D组较C组骨密度值明显提高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠胫骨、股骨的骨密度比较

2.2 大鼠肠道菌群检测结果 电针治疗12周后，采集4组大鼠粪便样本，对肠道菌群的16S rDNA V3～V4区进行高通量测序。结果以97%的一致性进行OTUs聚类分析。

2.2.1 OTUs分析：据聚类得到的OTUs分析结果和研究需求，分析组与组之间、各样本之间共有以及特有的OTUs，本研究小组数小于5，将结果绘制成韦恩图(Venn Graph)，从图1中可以看出，D组的OTUs数目较C组明显增多。

图1 4组OTUs分析结果

2.2.2 菌群分布情况：与A组、B组相比，C组的软壁菌门、放线菌门、脱铁杆菌门丰度增加(P<0.05)，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、 黑水仙菌门丰度降低(P<0.05)。与C组相比，D组的厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、黑水仙菌门丰度增加(P<0.05)，软壁菌门、放线菌门、脱铁杆菌门丰度降低(P<0.05)。见图2。

图2 电针对菌群门分类水平影响柱状图

与A组、B组相比，C组拟杆菌属、乳杆菌属和肠球菌属的丰度降低(P<0.05)。与C组相比，D组拟杆菌属、乳杆菌属和肠球菌属的丰度增加。见图3。

图3 电针对菌群属分类水平影响柱状图

与A组、B组相比，C组加氏乳酸菌和耐久肠球菌的丰度降低(P<0.05)。与C组相比，D组加氏乳酸菌和耐久肠球菌的丰度增加(P<0.05)。C组罗伊氏乳杆菌丰度较A组呈增加趋势(P>0.05)，较B组、D组降低(P<0.05)。见图4。

图4 电针对菌群种分类水平影响柱状图

3 讨论

肠道菌群是寄生于肠道的微生物群体，包括细菌、古生菌、真菌和病毒，它有人体细胞数量的10倍之多，又被称为人类的“第二基因组”[8]。在已知的众多种类的微生物中，绝大多数为厚壁菌、拟杆菌、微藻、放线菌和变形杆菌，这些微生物通过帮助食物消化吸收、分泌代谢产物、保护黏膜屏障功能，在维持人体健康中发挥重要作用[9]。近年来，随着人们对肠道微生物认识的不断加深，肠道微生物与骨代谢的关系已越来越引起人们的关注[10]。一项对38例平均年龄为62.9岁的绝经后妇女的前臂骨密度与肠道菌群的关系研究发现，骨密度与肠道菌群关系密切，低拟杆菌组的骨折发生率明显升高，提示拟杆菌属是调节骨代谢非常重要的菌属之一[11-12]。王飙等[13]观察了7例原发性骨质疏松症病人与7例健康对照者的肠道菌群，发现2组肠道菌群种类及数量差异具有统计学意义，芽单胞菌门、绿弯菌门、厌氧绳菌科、优杆菌等肠道菌群在骨质疏松症组中所占比例明显高于健康对照组，且绿弯菌门和酸杆菌门为骨质疏松症组特有。因骨质疏松的病因和发病机制被认为是涉及多个器官的复杂病变，提示肠道菌群门、属、种水平上的差异可能是骨质疏松病人因骨代谢引起肠道菌群变化的原因。进一步研究发现，PMOP发病的主要原因是由于雌激素水平下降影响了肠道菌群与宿主之间的动态平衡，特别是导致肠道菌群结构及丰度发生改变而引发免疫、炎症反应，导致肠道的通透性增加[3]。

本次研究发现，D组除骨密度较C组大鼠显著提高外，其大鼠的肠道菌群结构也较C组变化明显，例如，在属水平上，拟杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属变化明显，与相关文献研究结果基本一致[14]。在种水平上，少数与骨形成相关的菌种发生变化，其中罗伊氏乳杆菌显著增多，现有的研究证实罗伊氏乳杆菌代谢产生的有机酸、乙醇和罗伊氏乳蛋白等分子具有抗菌活性，能抑制病原微生物的定植、改变宿主体内共生菌群的组成，增强肠道屏障的能力，减少微生物从肠腔向组织的迁移[15]，同时罗伊氏乳杆菌能够改善OVX大鼠的骨钙流失，通过免疫调节改善骨质，减少破骨细胞的生成[16-17]。以上结果表明，本次实验中变化明显的拟杆菌群和罗伊氏杆菌群等，可能是针刺干预下OVX大鼠骨密度增加的主要影响因素。由于本研究仅为针刺对OVX大鼠肠道菌群结构影响的初步研究，暂未涉及详细的菌群通过何种机制影响骨质，其确切的机制有待日后进一步研究。