nm23-H1与MMP-9在异位子宫内膜组织中的表达及其意义

洪 娇，奚 玉，孙 青

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001；2.合肥市第二人民医院 妇产科，安徽 合肥 230000)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMS)是生育年龄女性较常见的一种疾病，病灶位于盆腔腹膜与卵巢，会导致痛经、性交痛、不孕、慢性盆腔痛的发生，严重影响患者生活质量[1-2]。EMS的发病机制目前尚不清楚。但有相关研究表明，EMS虽然属于一种良性疾病,但具有与恶性肿瘤类似的生物学特性，例如无限增长、生成新的血管和向远处侵袭等[3-4]。近年来医学研究揭示nm23核苷二磷酸激酶-1(nm23-H1)基因是抑癌基因[5-6]；除此之外，基质金属肽酶9(MMP-9)在细胞外基质的局部蛋白分解和白细胞迁移中可能起到重要作用，从而促进肿瘤细胞侵袭与转移[7-8]；相关研究揭示nm23-H1在多种肿瘤发展过程中可通过RAS-RAF-MEK-ELK1或MKK3/6-p38通路来下调MMPs在组织中的表达量，抑制肿瘤细胞降解细胞外基质的能力，最终可阻止肿瘤细胞的侵袭、种植[9]。雒洪志等研究显示在胆囊癌以及肺癌患者中nm23-H1通过MKK3/6-p38通路对MMP-9有负反馈作用[10]。近年来有研究考虑EMS中nm23-H1可能通过RAS-RAF-MEK-ELK1通路对MMP-9的表达存在负反馈调节作用，进而影响到EMS的发生[11]。本研究采用qRT-PCR和Western blot检测正常子宫内膜组织和异位内膜组织中nm23-H1和MMP-9的表达，探讨nm23-H1和MMP-9与EMS的相互关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取弋矶山医院妇产科30例EMS患者为研究组(2019年7月～2020年12月)，年龄26～52(37.80±7.47)岁。同时将35例正常子宫内膜者(取自弋矶山医院门诊因异常子宫出血行诊断性刮宫的育龄妇女，经病理检查确认为正常)为对照组，年龄21～51(35.78±7.30)岁。纳入标准:两组患者手术前在3个月内未使用过激素类药物，在无菌条件下采集新鲜组织标本约80～100 mg，于离心管中放置保存液保存(碧云天，上海)，-80℃保存，以便提取RNA及蛋白。

1.2 方法 nm23-H1、MMP-9 mRNA表达量的检测。入组当天，由病理科采用磷酸缓冲盐溶液清洗标本组织，Trizol(Invitrogen，美国)一步法提取组织总RNA，按照逆转录试剂盒(Thermo，美国)说明书进行逆转录反应cDNA，酶标仪(Thermo，美国)检测RNA浓度与纯度，后采用SYBR Green(Thermo，美国)试剂配得qRT-PCR反应25 μL体系，扩增用Step one Plus实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)进行。nm23-H1、MMP-9基因引物序列由primer 5.0设计，mRNA全长比对于BLAST进行后，序列无误。上海捷锐公司进行了相关合成，序列见表1。数据最终以所得结果的2-ΔΔCt值进行分析，以β-actin作为内参基因标定nm23-H1、MMP-9的表达量。

表1 PCR引物序列

1.3 Western blot检测nm23-H1、MMP-9蛋白表达 于冰上研磨组织，充分裂解后，经电动匀浆并超声，静置45 min于冰上，离心15 min(4℃，12 000 r/min)，取上清。用上海碧云天BCA试剂盒测定蛋白浓度，取10 μL蛋白，凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转法转膜，用5%脱脂奶粉，室温封闭85 min，每次5 min,1×TBST漂洗3次，置于内孵育盒，加美国CST兔源一抗，在4℃下过夜后，二抗[CST，美国，辣根过氧化物酶(HRP)标记]室温1.5 h孵育。经ECL显影、曝光，拍照及保存图像。

2 结果

2.1 两组一般资料对比 结果显示，两组患者年龄和孕次差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组患者一般资料比较[n(%)]

2.2 两组患者子宫内膜组织中nm23-H1、MMP-9 mRNA表达量比较 结果显示，研究组nm23-H1的mRNA表达量较对照组下调，而MMP-9的mRNA表达量较对照组上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.3 两组患者子宫内膜组织中nm23-H1和MMP-9的蛋白表达量比较 结果显示，研究组nm23-H1蛋白表达量(0.48±0.05)较对照组(1.29±0.06)降低，差异有统计学意义(t=58.531,P<0.001)；而研究组MMP-9蛋白表达量(2.20±0.09)较对照组(1.34±0.09)上调，差异有统计学意义(t=38.406,P<0.001)，见图1。

*P<0.05。

2.4 EMS组织中nm23-H1和MMP-9 mRNA表达相关性分析 有研究表明nm23-H1可以通过不同路径使基质金属蛋白酶(MMPs)表达降低[9],本研究对nm23-H1和MMP-9 mRNA在子宫内膜中的表达进行了相关性分析。结果显示EMS组织中nm23-H1和MMP-9 mRNA表达呈负相关(r=-0.315,P=0.012)。

3 讨论

近年来研究发现,nm23-H1是肿瘤转移抑制基因[6-8]，存在于很多与肿瘤转移有关的基因中[5]。nm23-H1基因表达降低一定程度上导致黑色素瘤、胃癌以及乳腺癌等癌症侵袭子宫，上述肿瘤的转移能力与nm23-H1基因表达呈负相关关系[12]；而有关MMP-9在各类肿瘤中作用的相关研究最多，现已经发现MMP-9基因是蛋白质编码基因,在细胞外基质的局部蛋白分解和白细胞迁移中可能起到重要作用[13]。有研究表明nm23-H1通过不同路径可以使MMPs表达降低，使金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的表达增高，从而降低肿瘤细胞的转移能力[14]。肺癌患者中nm23-H1基因转染可以使MMP-9分子的表达下降，调控MMP-9对癌细胞黏附侵袭恶性表型的逆转nm23-H1可以通过改变TIMP-1表达来实现[11]。有研究亦发现在结直肠癌患者中nm23-H1与MMP-9的表达呈负相关，nm23-H1基因的表达可以使MMP-9的表达下调；近年来研究证明nm23-H1与MMP-9之间的相互作用可能通过影响异位内膜转移的机理来影响EMS的发生[15]。

本研究结果表明，EMS组织中nm23-H1在mRNA及蛋白水平均存在低表达，MMP-9的表达情况则与之相反，表明nm23-H1和MMP-9基因可能影响到EMS的发生，同时EMS组中nm23-H1和MMP-9表达呈负相关(r=-0.31，P=0.01)，揭示nm23-H1和MMP-9在异位子宫内膜组织中表达异常，可能参与EMS的发病，其确切调节机制仍需进一步研究探讨。