LncRNA LEGLTBC/miRNA-199a-3p/FoxM1轴在糖脂毒性诱导胰岛β细胞增殖损伤中的作用

程 艺，邢宇杰，周思敏，孙 玥，华 强，孔 祥

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 内分泌科，安徽 芜湖 241001)

随着经济发展和生活方式改变，2型糖尿病的患病率不断攀升，已构成严重的公共卫生问题[1]。胰岛β细胞功能进行性减退是2型糖尿病发病的核心机制，也是病程进展的关键因素[2]。McGarry提出2型糖尿病实际是起源于代谢异常的“糖脂病”，即过量葡萄糖和脂质存在能够对胰岛β细胞造成协同损害，这种病理现象被称之为糖脂毒性[3]。糖脂毒性导致β细胞进行性损伤的病理生理机制迄今尚未完全阐明。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)作为新的细胞生物调节因子日益受到关注[4]。lncRNA是指长度超过200 nt的RNA分子，不编码蛋白，可与蛋白质、DNA和RNA相互作用[5]。本课题组前期采用RNA-Seq筛选出在高糖/高脂(high glucose and palmitate，HG/PA)孵育的INS-1细胞(大鼠胰岛β细胞株)中显著低表达的lncRNA NONRATT003679.2(low expression in glucolipotoxicity-treated beta cells，LEGLTBC)，并发现其促进胰岛β细胞凋亡和氧化应激[6]。本研究在前期工作基础上，利用HG/PA建立胰岛β细胞糖脂毒性损伤模型，进一步探讨LEGLTBC调控β细胞增殖的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及器材 1640培养基和胎牛血清，美国Gibco公司;TRNzol RNA提取试剂，美国ThermoFisher公司；荧光定量PCR试剂盒，美国QIANGEN公司；EdU细胞增殖试剂盒，广州锐博公司；CCK-8细胞活性试剂盒，江苏凯基公司。

1.2 细胞培养及转染 1640培养基培养INS-1细胞，培养条件为37℃、5%CO2。INS-1细胞生长汇合到70%～80%，进行转染或感染处理。其中siRNA LEGLTBC(si-LEGLTBC)、si-RNA FoxM1(si-FoxM1)和阴性对照(si-NC)；miR-199a-3p mimic(miR-199a-3p)、miRNA阴性对照(miR-NC)；miR-199a-3p抑制剂(anti-miR-199a-3p)和miRNA抑制剂阴性对照(anti-NC)购自广州锐博公司；LEGLTBC过表达腺病毒(Ad-LEGLTBC)和对照腺病毒(Ad-NC)购自上海汉恒公司。转染或感染48 h后，INS-1细胞予以25 mmol/L葡萄糖(HG)和0.5 mmol/L棕榈酸(PA)孵育24 h后进行后续相关实验。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-PCR) TRNzol提取INS-1细胞总RNA，逆转录后进行检测LEGLTBC和miR-199a-3p的表达。引物序列如下，LEGLTBC为F:5′-GCTGTACCTCGAATGAATCC-3′,R:5′-AAACCTCTCTCCCAGTAGTC-3′;miR-199a-3p为F:5′-AGCAGATTCCTACGGTTCGTCG-3′,R:5′CGCATCTATC-GATGTCAGTCGCT-3′；U6为F:5′-CGAGCUGGUAA-AGAAUUUATT-3′，R:5′-UAAAUUCUUUACCAGCU-CGTT-3′。

1.4 Western blot检测蛋白表达 RIPA裂解液提取细胞总蛋白后，BCA法测蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到NC膜上。用5%BSA封闭2 h后将NC膜中加入FoxM1(1∶1 000)，CyclinD1(1∶1 000)和β-actin(1∶3 000)抗体4℃孵育过夜。室温下二抗孵育2 h。ECL显影并拍照。

1.5 EdU法检测INS-1细胞增殖 INS-1细胞经相应处理后加入EdU标记2 h，然后经过固定、Apollo染色、Hoechst染色，倒置荧光显微镜检测并计算EdU阳性信号细胞百分比。

1.6 CCK-8比色法检测细胞活力 处理后的INS-1细胞接种于96孔板中，加HG/PA培养24 h。加入10 μL CCK-8继续培养2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.7 荧光素酶报告实验 大鼠INS-1细胞种板后，将含有miR-199a-3p的结合序列的野生型LEGLTBC-WT/FoxM1-WT或含有miR-199a-3p结合位点中的突变序列LEGLTBC-MUT/FoxM1-MUT和miR-199a-3p mimic、miR-NC共转染后48 h测量荧光素酶活性。

2 结果

2.1 沉默LEGLTBC加重HG/PA诱导的INS-1细胞增殖损伤 与本课题组先前研究一致[6]，HG/PA孵育INS-1细胞6、12、24 h后，LEGLTBC的表达均较Con组降低(P<0.05)。采用EdU染色(标记S期细胞)和CCK-8实验测定细胞增殖能力，结果表明siRNA沉默INS-1细胞LEGLTBC增加糖脂毒性导致的胰岛β细胞增殖损伤(P<0.05)(图1)。

A.RT-PCR检测LEGLTBC在25 mmol/L HG/0.5 mmol/L PA孵育6、12、24 h的INS-1细胞中的表达；B.si-RNA LEGLTBC转染后，RT-PCR检测LEGLTBC表达；C～D.应用EdU染色评估细胞增殖情况。红色荧光为EdU阳性信号。蓝色荧光为Hochest染色细胞核。EdU阳性细胞百分比以直方图显示；E.采用CCK-8法检测INS-1细胞活力。结果以n=4～5个独立实验的表示。*P<0.05。

2.2 过表达LEGLTBC减轻HG/PA导致的INS-1细胞增殖损伤 为了进一步阐明LEGLTBC的生物学功能，本课题组构建了过表达腺病毒LEGLTBC。图2A表明Ad-LEGLTBC感染上调其表达7.16倍(P<0.05)。图2B～D表明，LEGLTBC上调可缓解HG/PA孵育所诱导的INS-1细胞增殖损伤(P<0.05)。

A.Ad-LEGLTBC感染INS-1细胞48 h后，RT-PCR检测HG/PA处理24 h后LEGLTBC表达；B～C.应用EdU染色评估细胞增殖情况。EdU阳性细胞百分比以直方图显示；D.采用CCK-8法检测相同处理INS-1细胞活力。结果以n=4～5个独立实验的表示。*P<0.05。

2.3 LEGLTBC靶向miR-199a-3p 利用生物信息学软件RNA22 V2和RegRNA 2.0分析发现miR-199a-3p与LEGLTBC具有高亲和力。为了确认LEGLTBC与miR-199a-3p之间的联系，将miR-199a-3p mimic和LEGLTBC-WT共转染，发现INS-1细胞中荧光素酶活性降低(P<0.05)；而共转染miR-199a-3p mimic和LEGLTBC-MUT的细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)(图3A、B)。随着HG/PA孵育时间的延长，INS-1细胞中miR-199a-3p表达水平均升高(P<0.05)(图3C)，表现与LEGLTBC表达趋势相反。LEGLTBC过表达下调miR-199a-3p表达(P<0.05)，沉默LEGLTBC能促进miR-199a-3p表达(P<0.05)(图3D)，提示LEGLTBC是与miR-199a-3p相互作用的竞争性内源性RNA。降低miR-199a-3p表达可缓解HG/PA孵育所诱导的INS-1细胞的增殖减慢(P<0.05)(图3E～G)。上述结果提示，LEGLTBC通过调控miR-199a-3p表达进而影响HG/PA引起的INS-1细胞增殖损伤。

A.LEGLTBC和miR-199a-3p的预测结合序列；B.INS-1细胞转染miR-199a-3p模拟物、LEGLTBC-WT、LEGLTBC-MUT 48 h后测定荧光素酶活性；C.RT-PCR检测miR-199a-3p在25 mmol/L HG/0.5 mmol/L PA孵育6、12、24 h的INS-1细胞中的表达；D.Ad-LEGLTBC或si-LEGLTBC处理INS-1细胞48 h后，RT-PCR检测Con或HG/PA处理24 h后miR-199a-3p表达；E～F.miR-199a-3p处理后，EdU染色评估HG/PA孵育的INS-1细胞增殖情况。EdU阳性细胞百分比以直方图显示；G.采用CCK-8法检测相同处理INS-1细胞活力。结果以n=4～5个独立实验的表示。*P<0.05。

2.4 miR-199a-3p靶向FoxM1 本研究进一步探讨miR-199a-3p调控INS-1细胞增殖的可能机制。利用生物信息学软件TargetScan筛选出miR-199a-3p的靶基因FoxM1，即miR-199a-3p和FoxM1可能存在着竞争性结合。HG/PA孵育的INS-1细胞中FoxM1蛋白表达呈时间依赖性降低(P<0.05)(图4A、B)。共转染miR-199a-3p模拟物和FoxM1-WT导致INS-1细胞中荧光素酶活性降低(P<0.05)，而与共转染miR-199a-3p模拟物和FoxM1-MUT的细胞中荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)(图4C、D)。敲减miR-199a-3p可升高FoxM1表达(P<0.05)(图4E、F)，提示miR-199a-3p竞争性结合FoxM1并调控其表达。

为明确糖脂毒性导致胰岛β细胞增殖损伤是否与FoxM1有关，本研究利用si-FoxM1沉默其表达，发现细胞周期蛋白cyclinD1在HG/PA孵育的INS-1细胞表达降低(P<0.05)(图4G～I)。EdU细胞增殖实验和CCK-8实验显示抑制FoxM1表达加重糖脂毒性诱导的INS-1细胞增殖能力损伤(P<0.05)(图4J～L)。

A～B.Western blot检测FoxM1在25 mmol/L HG/0.5 mmol/L PA孵育6、12、24 h的INS-1细胞中的表达；C.miR-199a-3p和FoxM1的预测结合序列；D.INS-1细胞转染miR-199a-3p模拟物、FoxM1-WT、FoxM1-MUT 48 h后测定荧光素酶活性；E～F.anit-miR-199a-3p转染后，Western blot检测HG/PA孵育INS-1细胞FoxM1蛋白表达；G～I.si-FoxM1转染后，Western blot检测HG/PA孵育INS-1细胞FoxM1和细胞周期蛋白cyclinD1表达；J～K.miR-199a-3p处理后，EdU染色评估HG/PA孵育的INS-1细胞增殖情况。EdU阳性细胞百分比以直方图显示；L.采用CCK-8法检测相同处理INS-1细胞活力。结果以n=4～5个独立实验的表示。*P<0.05。

2.5 LEGLTBC调控FoxM1表达 图5A、B显示，过表达LEGLTBC时FoxM1表达升高，而抑制LEGLTBC表达，FoxM1表达降低(P<0.05)。以上结果表明，LEGLTBC正向调控miR-199a-3p的靶基因FoxM1表达。Ad-LEGLTBC或Ad-LEGLTBC+si-FoxM1转染INS-1细胞。LEGLTBC过表达增加了HG/PA处理的INS-1细胞中FoxM1表达，而si-FoxM1转染降低了LEGLTBC触发的FoxM1表达增强(P<0.05)(图5C～E)。此外，过表达LEGLTBC上调了HG/PA处理的INS-1细胞中细胞周期蛋白cyclinD1的表达，而沉默FoxM1后LEGLTBC过表达的保护作用被抑制(P<0.05)(图5C～E)。结果提示LEGLTBC通过促进FoxM1表达调控糖脂毒性诱导的INS-1细胞增殖损伤。

A～B.HG/PA孵育的INS-1细胞，Western blot检测过表达或沉默LEGLTBC后FoxM1的表达；C～E.Ad-NC、Ad-LEGLTBC、Ad-LEGLTBC+si-NC、Ad-LEGLTBC+si-FoxM1分别转染INS-1细胞，HG/PA处理后，Western blot检测FoxM1和细胞周期蛋白CyclinD1的表达。结果以n=3～4个独立实验的表示。*P<0.05。

3 讨论

本研究发现lncRNA LEGLTBC在HG/PA孵育的INS-1细胞中表达降低。沉默LEGLTBC可显著增加糖脂毒性导致的胰岛β细胞增殖损伤，而过表达LEGLTBC则减轻增殖损伤，表明LEGLTBC参与调控糖脂毒性引起的INS-1细胞增殖损伤。

目前，有关LncRNA的研究主要集中在肿瘤学领域，研究结果显示其是肿瘤发生发展的重要启动及调控因素。Huang等[7]根据LncRNA测序确定了利拉鲁肽对2型糖尿病的可能治疗靶点，Sathishkumar等[8]发现了糖尿病患者胰岛中LncRNA与血糖控制不良、胰岛素抵抗和β细胞的衰老以及细胞炎症相关。LncRNA有多种功能，如影响mRNA的稳定性和翻译、影响蛋白稳定性、靶向miRNA等。其中结合miRNA并且调控下游mRNA表达是其重要的调控功能之一，这种RNA之间相互作用被称为竞争性内源RNA。本研究表明miR-199a-3p在HG/PA孵育的INS-1细胞中表达升高，这与研究报道miR-199a-3p在高脂饮食喂饲小鼠胰岛中表达升高相一致[9]。功能学实验证实LEGLTBC是与miR-199a-3p相互作用的竞争性内源RNA，两者表达呈负相关。上调LEGLTBC会抑制miR-199a-3p的表达，抑制LEGLTBC则结果相反。因此，我们认为LEGLTBC通过影响miR-199a-3p发挥效应。

本课题组研究发现FoxM1是miR-199a-3p的下游靶基因，敲减miR-199a-3p可升高FoxM1表达。转录因子FoxM1是维护胰岛β细胞功能的重要因子，缺少FoxM1可导致胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌能力受损[10]。这与我们的研究结果一致，即HG/PA孵育的INS-1细胞中FoxM1蛋白表达降低，沉默FoxM1后细胞周期蛋白cyclinD1表达下降，进一步加重糖脂毒性导致的胰岛β细胞增殖损伤。随后的研究发现过表达LEGLTBC时FoxM1表达升高；而抑制LEGLTBC表达则降低FoxM1表达。沉默FoxM1可拮抗LEGLTBC过表达对糖脂毒性损伤的保护作用。上述结果表明在HG/PA孵育INS-1细胞中低表达的LEGLTBC影响miR-199a-3p表达，进而抑制FoxM1表达并影响INS-1细胞增殖。

本研究阐明了lncRNA LEGLTBC/miRNA-199a-3p/FoxM1轴在HG/PA诱导胰岛β细胞增殖损伤中的作用，揭示了糖脂毒性导致β细胞受损的新机制，为胰岛β细胞保护开辟了新的思路。