TRH对离体脊髓内在调控运动神经元通路的影响

漆黎明，汪萌芽

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

脊髓运动神经元(motoneuron，MN)是躯干和四肢反射活动的初级中枢，是躯体运动中信息由中枢传到效应器的最后一个环节，下行激活、外周传入和脊髓内在神经元网络等多种通路参与其活动的调控。本实验室既往研究表明，脊髓同侧中央管周围区(ipsilateral pericentral canal，iPCC)可能是脊髓内在调控MN活动的通路，其向MN传入的突触反应以兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)为主[1]。促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)是下丘脑合成和分泌的一种肽类激素，其广泛分布于丘脑、脑干、脊髓腹角和中央管周围区等[2-4]，并参与各种生理功能的调节，包括运动[5]、睡眠[6]和摄食[7-8]等。TRH能使脊髓MN产生去极化反应，直接兴奋MN，也能增强MN的突触反应，如TRH可增强由电刺激脊髓对侧腹外侧索(contralateral ventrolateral funiculus，cVLF)诱发的EPSP(cVLF-EPSP)，也可增强由电刺激脊髓同侧背根(ipsilateral dorsal root，iDR)诱发的EPSP(iDR-EPSP)[9-10]。目前国内外有关TRH对脊髓iPCC给予电刺激在MN诱发的EPSP(iPCC-EPSP)的影响尚未见报道，且iPCC可能与脊髓的初级运动中枢有关，iPCC-MN通路对运动学习机制的研究具有重要作用，此外TRH还可以改善机体的共济失调、治疗脊髓损伤和脊髓小脑病变，具有重要的临床意义。因此本研究通过制备新生大鼠脊髓切片、应用脊髓MN细胞内记录技术，观察TRH对iPCC至MN的兴奋性突触传递的影响，以了解TRH对脊髓内在调控MN通路的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物与药品 8～14日龄的新生SD大鼠60只购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号：SCXK(鲁)20190003]，雌雄不拘。人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)各成分浓度(mmol/L)：NaCl 127.0、KCl 1.9、KH2PO41.2、CaCl22.4、MgSO4·7H2O 1.3、NaHCO326.0、Glucose·H2O 10.0。TRH(Sigma，USA)，实验前用蒸馏水配成母液(5 mmol/L)，在-20℃冰箱中冷冻备用。给药时，将母液用ACSF稀释到所需浓度，灌流给药。

1.2 脊髓分离与切片制备 根据报道方法[11]，取8～14日龄健康的SD新生大鼠，在乙醚麻醉状态下行椎板切除术，快速轻柔地分离出脊髓(含腰骶膨大)，将脊髓用胶水固定在琼脂凝块上并整体固定于振荡切片机(Vibratome 1500，Technical Products International Inc.，USA)的冰浴载物浴碟内，调整振荡切片机的速度，横向切取3～7片脊髓厚片(400～500 μm)，再移入事先用5% CO2+95%O2混合气体饱和的ACSF中孵育50 min左右，静置在25℃左右的室温下备用。

1.3 电生理记录 将孵育好的脊髓切片轻柔地移入全浸式记录浴槽中并用丝网固定，注意暴露出脊髓腹角和iPCC，将处于室温下并经混合气体饱和的ACSF，经恒流泵(郑州宝晶电子科技有限公司)持续灌流脊髓切片。选用充灌3 mol/L乙酸钾、电阻为70～150 ΜΩ的微电极，借助MP-1型微操纵仪(NARISHIGE，Japan)在双目立体显微镜下穿刺脊髓腹角运动神经元，通过微电极放大器(Axoclamp 900A，Axon Instruments，USA)对采集到的电信号进行处理后，再经转换接口(DigiData 1440A，Axon，USA)输入计算机，并用Clampex 10.2软件(Axon)进行采样、记录和储存。细胞内电流刺激经微电极注入细胞，两根同芯双极刺激电极分别置于脊髓iPCC与腹根(ventral root，VR)，给予的电刺激由三通道电刺激器(SEN-7103，NIHON KOHDEN，Japan)输出，然后经隔离器(NIHON KOHDEN，Japan)至刺激电极。

利用置于脊髓VR的刺激电极，对记录稳定、静息电位负于-60 mV且有超射的细胞进行逆行激活鉴定，若记录到“全或无”特点的逆行动作电位，即可鉴定为MN。

2 结果

2.1 TRH对离体脊髓MN膜电学性质的影响 对25个脊髓MN给予0.2 μmol/L TRH后，细胞产生去极化反应(P<0.01)，且去极化反应的幅度可随灌流时间延长而增大，见图1。用药后MN产生去极化反应(P<0.01)，并伴有膜电阻增大(P<0.01)，同时TRH延长锋电位的半幅时程(P<0.01)，降低锋电位的幅度和最大上升斜率(P<0.01)、AP的幅度和超射(P<0.01)，也降低了阈电位水平(P<0.05)，见表1。

表1 TRH对离体脊髓MN膜电学性质的影响

Control：对照；TRH：灌流TRH(0.2 μmol/L)5 min及7 min；Wash：ACSF冲洗25 min。

另外，在4个脊髓MN灌流0.2 μmol/L和1.0 μmol/L TRH均5 min，细胞呈浓度依赖性去极化反应，见图2。

Control：对照；TRH：灌流0.2 μmol/L和1.0 μmol/L TRH；Wash：ACSF冲洗35 min。

2.2 TRH对离体脊髓MN放电频率的影响 有关TRH对MN内在兴奋性的影响，主要观察了TRH对刺激电流-频率曲线(I-F曲线)的影响。灌流0.2 μmol/L的TRH(n=9)，细胞除产生去极化外，还增加了不同电流强度下MN动作电位发放频率，且作用能被洗出，见图3。

Control：对照；TRH：0.2 μmol/L；Wash：冲洗15 min。

2.3 TRH对iPCC-EPSP的影响 在脊髓iPCC给予电刺激(0.1～0.2 ms，0.1 Hz，10～100 V)诱发出iPCC-EPSP，待记录稳定后，灌流0.2 μmol/L TRH，在3个MN的iPCC-EPSP上出现锋电位发放，见图4。

Control：对照；TRH：0.2 μmol/L；Wash：ACSF冲洗20 min。图中每一记录为10次采样的叠加，箭头所指为iPCC电刺激伪迹。

在另外18个MN的iPCC-EPSP灌流0.2 μmol/L TRH，可增大iPCC-EPSP的幅度，见图5。可见TRH能增大iPCC-EPSP的幅度(P<0.01)、曲线下面积(P<0.01)、时程(P<0.01)和最大下降斜率(P<0.05)，作用可被ACSF洗出。同时，按报道方法[12]，进行表观受体动力学分析，K1值呈增大趋势，Vmax值增大(P<0.01)，KT值减小(P<0.05)，K2值也呈现减小趋势，见表2。

Control：对照；TRH：0.2 μmol/L；Was：ACSF冲洗40 min。图中每一记录为10次采样的平均曲线，箭头所指为iPCC电刺激伪迹。

表2 TRH对离体脊髓MN iPCC-EPSP的影响

3 讨论

本研究观察到TRH通过使MN膜发生去极化和增加MN放电频率以兴奋脊髓MN，这与文献报道的一致[9-10]，结合膜电阻增大，说明可能与细胞膜上K+通道关闭有关[13-14]。同时，TRH受体属于G蛋白耦联受体，TRH受体被激活后可激活磷脂酶C，使胞内Ca2+浓度升高，从而出现一系列级联放大效应[15]。此外胞内Ca2+浓度显著升高也可兴奋MN，因此，G蛋白信号转导系统也有可能参与了TRH兴奋MN的调节。

另外，TRH可使iPCC-EPSP出现锋电位发放，也可增大其幅度、曲线下面积和时程。对iPCC-EPSP进行表观受体动力学分析，K1呈增大趋势，K2值呈减小趋势以及KT值显著减小，说明用药后突触后递质与受体的结合速率增大、解离速率减小以及亲和力增强，提示TRH对iPCC-EPSP起易化作用。TRH可增大脊髓iDR-EPSP，在去极化期间通过手动将膜电位钳制至对照水平时仍呈增大作用，TRH也可增大脊髓cVLF-EPSP，且将抑制性氨基酸受体阻断后仍呈增大作用[9-10]。这进一步说明TRH对iPCC-EPSP起易化作用。而关于TRH易化iPCC-EPSP的机制，研究表明，在脊髓上TRH增强了由N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)介导的突触反应[16]，而NMDAR又介导了iPCC-EPSP，这提示TRH对iPCC-EPSP的增大反应可能与兴奋NMDAR有关。此外TRH可通过改变膜的电学反应特性增强由NMDAR调节的EPSP[17]，还可通过对乙酰胆碱的调节来影响突触传递。Kinoshita等发现，TRH类似物可以增强乙酰胆碱的释放和合成[18]，而位于iPCC的胆碱能V0c中间神经元，其C型突触终扣上胆碱能受体能调控MN，激活M2-AChR可增强MN的兴奋性[19-20]，且烟碱型乙酰胆碱受体还可促进MN之间的快速突触耦合[21]，因此乙酰胆碱可能参与了TRH对iPCC-EPSP的调节。由此可见，K+通道关闭、膜电阻增大、NMDAR的兴奋以及胆碱能受体的激活都可能参与了TRH对iPCC-EPSP调节，但其具体机制还有待研究。同时，TRH可以改善小脑共济失调[22]、治疗脊髓损伤[23]，其类似物对治疗脊髓性肌萎缩症也具有潜在功效[24]。总之，TRH对脊髓内在调控MN通路以及治疗脊髓运动障碍具有重要的生物学和临床意义。