酶联免疫法检测猪肉中的司帕沙星

邢广旭，赵东，孙雪峰，温留丁，张颖硕，张改平

（河南省农业科学院，动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450003）

司帕沙星（SPFX）是第三代氟喹诺酮类抗菌剂，因其对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、支原体、衣原体、分枝杆菌等具有良好的抗菌活性，被广泛应用于兽医传染病的治疗和预防。它能抑制拓扑异构酶 IV和DNA旋转酶的功能，导致微生物DNA复制和蛋白质合成的失败，具有强烈而广泛的杀菌作用。

近年来，司帕沙星（SPFX）不仅用于细菌感染的预防和治疗，而且作为一种促进生长的工具。由于SPFX的滥用，其残留和对该抗生素产生耐药性的细菌的出现已成为主要的公共卫生问题[1-3]。根据已发表的文献，氟喹诺酮类药物的毒副作用包括食欲减退、呕吐、光毒性、遗传毒性等。

尽管SPFX的急性毒性在食品安全领域尚未见报道，但考虑到未知的潜在生态风险，低水平SPFX的食品监测是必不可少的。越来越多的国家正在制定最大残留量（MRL）和氟喹诺酮类原料药的停药时间。根据食品和药品的不同来源，氟喹诺酮类原料药的最大残留限量设定在30～1500 μg/kg[4]。我国农业部已制定了氟喹诺酮类原料药的动物种类、剂量、用法和停药期限（No.278，2003.5.22）。为了监测动物性食品中SPFX的残留量，有必要建立简便、快速的分析方法。

目前，动物性食品中氟喹诺酮类药物的分析方法有生物测定法、高效液相色谱法、荧光分析法、分光光度法、液相色谱-串联质谱法和毛细管电泳法。但是当涉及到多类生物样品时，这些方法已经显示出检测SPFX的一些缺点，例如耗时、昂贵、低吞吐量、高背景或需要昂贵的设备。因此，有必要建立一种简便、灵敏、低成本的SPFX分析方法。

在以往的研究中，酶联免疫吸附法（ELISA）已广泛应用于食品和动物组织（肌肉、血清、肝、肾、蛋和乳）中包括氟喹诺酮类药物在内的兽药残留的筛选[5-8]。一些氟喹诺酮类药物，如诺氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、马波沙星、环丙沙星和达诺氟沙星，已被研究用于发展免疫分析[8-12]。根据目前报道，ELISA法测定动物性食品和食品中SPFX的报道还很少。

本研究的主要目的是建立一种免疫单克隆抗体ELISA检测限度。在检测猪肉中SPFX残留时，具有特异性高，背景低和无需样品预处理的特点。

1 材料与方法

1.1 试剂

司帕沙星、氟罗沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、莱克多巴胺、特布他林、庆大霉素、沙布他莫和克伦特罗由国家药品生物制品检定所（中国北京）提供。N，N'-二环己基碳二亚胺、弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。卵清蛋白和牛血清白蛋白购自上海上宝生物科技有限公司（中国上海）。吐温-20和N，N-二甲基甲酰胺购自中国广东省广州市东宏化工公司。3，3'，5，5'-四甲基联苯胺购自Amresco（Solon，OH）。山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物购自军事医学研究所（中国北京）。

1.2 仪器

ELISA在聚苯乙烯96孔微量滴定板（Bio-Basic公司）中完成。紫外数据是从日立公司的 U-4100分光光度计收集。微孔板阅读器 450/550来自 Bio-Rad（加利福尼亚州里士满）。超纯水由milipore（Bedford，MA）获得。

1.3 缓冲液和溶液

在免疫分析过程中，所有试剂和缓冲液的制备均采用超纯去离子水。磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）由147 mmol/L KH2PO4、136.9 mmol/L NaCl、268.3 mmol/L KCl和 809.7 mmol/L Na2HPO4·12H2O 组成。洗涤缓冲液（PBST）为含有0.05%吐温-20的PBS缓冲液（0.01 mmol/L，pH 7.4）。使用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（由 17.5 mmol/L NaHCO3和 7.5 mmol/L Na2CO3组成，pH 9.6）制备包衣缓冲液。底物缓冲液为0.1 mol/L醋酸钠/柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）。含有0.05%猪血清的洗涤缓冲液为阻断缓冲液。为制备基质溶液，将 1.27 mg 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺溶解于 0.5 mL甲醇中并添加0.5 mL甘油。

1.4 免疫原和包被抗原的制备

免疫原通过使用NHS酯法[11]（图1）将SPFX与BSA结合来合成。首先，将半抗原（1.5 mg）溶解于DMF（1 mL）中。向溶液中加入NHS（1.80 mg）和DCC（3.20 mg），在无光和室温下混合12 h。然后，将BSA（5.10 mg，溶于2 mL PBS）缓慢地添加到剧烈搅拌的活性NHS溶液中，然后在室温下搅拌4 h。最后，将半抗原-BSA结合物在4 ℃透析72 h。将获得的SPFX-BSA免疫原冻干并在-20 ℃储存。包被抗原SPFX-OVA的设计方法相同。用紫外吸收光谱对偶联物进行了表征。

1.5 单克隆抗体产生

3只雌性BALB/C小鼠购自河南省实验动物中心（实验动物许可证号为SYXK(E)2021-0003）。小鼠在光暗循环12 h，室温24±2 ℃和有饮用水条件下饲养。用免疫原BSA-SPFX多部位皮下免疫小鼠。初始接种为皮下注射0.15 mg结合物，加入0.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）和0.5 mL不完全佐剂。其余3次强化免疫均以 0.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）和 0.5 mL iFA注射0.25 mg SPFX-BSA，间隔20 d。从第三次免疫开始，使用ELISA法测定血清滴度。用抗血清分离材料中的颗粒，将血液凝块放在4 ℃过夜。

通过ELISA法测定血清效价，让血液凝块在4 ℃过夜分离带有抗血清的颗粒物。部分细胞融合程序和亚克隆条件在此仅作简要描述。

NS0骨髓瘤细胞在添加有 100单位/mL、10%FBS、青霉素链霉素100 μg/mL的RPMI-1640中维持在指数生长阶段。取对SPFX竞争最强、效价最高的小鼠脾脏，与骨髓瘤细胞以10:1的比例与PEG 1500融合。融合细胞分布于96孔培养板中，小鼠腹腔巨噬细胞制备与选择性HAT培养基结合前一天。扩展孔培养显示SPFX识别活性，以有限稀释进行亚克隆3次。菌落在含有冷冻液氮和10%二甲基亚砜（DMSO）的培养基中冷冻，然后解冻3次以选择产生的克隆抗体的稳定性。成熟雌性BALB/c小鼠腹腔注射（ip）0.5 mL石蜡10 d前接受IP进入阳性杂交瘤细胞，注射后10 d收集腹水。小鼠用10%水合氯醛1～2 mL腹内注射，然后根据改变的辛酸硫酸铵沉淀（CAASP）测定确定mAb的纯化。mAb在这项工作中表现出最高的滴度和灵敏度。所有实验程序均按照郑州大学动物护理意向标准和实验动物使用委员会的指导方针进行。

1.6 间接竞争ELISA

将 50 μL SPFX-OVA 溶液（在包被缓冲液中为5000 μg/L）包被在每个孔中。37 ℃孵育2 h，用洗涤缓冲液洗涤5次。然后，将封闭缓冲液（250 μL）加入到每个板中，4 ℃孵化过夜。再次用洗涤缓冲液洗涤4次后，每孔加入50 μL适当稀释的抗SPFX抗体和50 μL样品，37 ℃孵育30 min。再次洗板四次，羊抗鼠 IgG-HRP（50 μL/孔，1:1000）37 ℃孵育 30 min。2.5 mL缓冲液和2.5 mL底物溶液缓慢混合至显色。将混合物（50 μL/孔）加入样品中，并将板在室温下温育10 min。每孔50 μL终止液终止反应。通过酶标仪在450 nm处测定与板结合的酶活性。免疫前提取的血清作为阴性对照。

1.7 检测的灵敏度和特异性

测定B/B0比值为0.5时的抑制剂浓度（IC50值）和交叉反应性（CR），以评价该方法的特异性和敏感性。用四种相关化合物进行竞争性免疫测定，包括氟甲喹、恩诺沙星、环丙沙星、氟罗沙星和其他几种化合物。这四个化合物的选择基本上是因为它们在结构上与SPFX有关。测试氟喹诺酮API部署到icELISA程序中，如上所述用于SPFX。CR值计算如下：

1.8 猪肉提取物的制备及HPLC分析

猪肉样品在郑州市场购买并由郑州农业部监督检验中心采用高效液相色谱法（HPLC）检测。将不含SPFX的猪肉末样品（5 g）用5 mL均质提取溶剂1:5（V/V）甲醇和PBS均质化，以调节pH值为7.4和6N盐酸。匀浆在1 min涡旋混合器中混合，剧烈振荡35 min，然后以12000 r/min离心1.5 h。将上清液用测定缓冲液稀释十倍，然后将其应用于微量滴定板。ELISA和HPLC分析方法对同一样品进行定量比较两种方法的一致性。高效液相色谱分析在安捷伦 1200系统上进行。安捷伦Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm粒径），25 ℃下流速为1 mL/min；保持以下条件：洗脱液：乙腈30.05 mol磷酸盐缓冲液（pH 2.4）（15:85，V/V）；进样量：20 mL。在这种情况下，SPFX保留时间为13 min。猪肉样品的含量分别为50、225、622 μg/L，分别代表低、中和高水平的残留。

1.9 统计分析

实验数据被表示为几个实验的 x±S。使用 SPSS 15.0软件对方差进行单向ANOVA分析，评估了统计学意义α。

2 结果与讨论

2.1 半抗原结合

为了制备高质量的抗体，发展高灵敏度、特异性的免疫分析方法是非常有必要的。SPFX（分子量：392.41）作为一个小分子，必须对目标分析物的分子结构进行适当的修饰。由于SPFX分子羧基的第3位为阳性，使最常用的蛋白质（BSA和 OVA）直接与其结合。

2.2 抗体特性

间接 ELISA法测定的单克隆抗体效价是以一个吸光度值相互稀释两次的结果，对抗体与SPFX和其他氟喹诺酮类药物的结合能力进行了评价。恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、环丙沙星、莱克多巴胺、庆大霉素、沙丁胺醇、特布他林和克伦特罗的代表性ELISA曲线如表1所示，从该试验获得的IC50值如图2所示。它显示出与IC50值几乎相等的相对亲和力。

表1 SPFX单抗与竞争化合物的CRTable 1 The CR of SPFX mAb with compete compounds

2.3 ICESIA的优化

使用棋盘法测试包衣抗原 SPFX-OVA、抗体和GaRIgG HRP的浓度[13]。包被抗原的SPFX-OVA浓度为 2000 μg/L；单克隆抗体效价为 1:1.6×105；GaRIgG-HRP的稀释度为1:1000。

在不同孵育条件下（4 ℃过夜、60 min过夜、37 ℃过夜120 min）检测包被抗原。在4 ℃下涂覆过夜或在37 ℃下涂覆120 min，孵育效果无显著差异。结果表明，在37 ℃保温60 min时，其IC50值较高（＞20 μg/L），最终在37 ℃保温120 min。免疫反应时间分别为30 min、60 min和120 min。结果表明，免疫反应60 min效果最好，IC50最低。

还应仔细选择封闭缓冲液，因为它用于防止非特定吸光度[14]。用2000 μg/L OVA-SPFX在37 ℃下包覆2 h，洗净后用5%猪血清、5%脱脂奶粉或0.5% BSA每孔200 μL分别在37 ℃下封闭30 min、1 h和2 h。以1/1.6×105稀释SPFX mAb作为阳性对照。以产生最大P/N值的阻断液和阻断时间为最优。三种阻断剂阻断1 h和2 h的P/N值无显著性差异。所有这些条件都表明培养板完全被封闭，因此在37 ℃下与5%猪血清孵育1 h，所以在本研究中被选为阻断缓冲液。室温下孵育10 min，P/N值最大，孵育时间越长，P/N值越低；因此，以10 min为最佳。

2.4 方法性能

IC50值是评价ELISA敏感性的重要指标，IC50值越低，检测灵敏度越高。在本研究中，IC20～IC80值范围为3.87至248.12 μg/L，R2=0.9827（图3）。IC50平均值为31 μg/L，表明已建立的icELISA具有高度灵敏。

从表1可以看出，含有四种结构相关化合物的抗体的CR值为0.31%～11.99%；抗体与其它化合物的识别率很低（CR＜0.31%）。CR值可以清楚地表明本研究中获得的单克隆抗体对目标分析物SPFX表现出非常高的特异性。对所开发的测定方法在猪肉中 SPFX残留量测定中的适用性进行了测试，结果如表2所示。在本研究中，回收率研究的样品是通过在PBS中稀释提取物制备的，无需进一步处理。

表2 用SPFX掺加的猪肉的批间和批内差异掺加的SPFX（μg/L）批内批间Table 2 Inter-assay and intra-assay variations of pork spiked with SPFX spiked SPFX (μg/L) intra-assay inter-assay measured

2.5 猪肉样品分析

应用icELISA法测定了郑州市猪肉中SPFX的含量。样品1、样品2和样品3的检出浓度分别为48.77、219.32 和 614.63 μg/L（表3）。

表3 通过ELISA和HPLC样品测定的猪肉样品中SPFX的浓度Table 3 Concentrations of SPFX in pork samples determined by ELISA and HPLC Sample

2.6 讨论

如上所述，通过 DCC方法将载体蛋白上的羧基转化为伯胺基。采用紫外吸收法分别测定BSA、SPFX和SPFX-BSA。在紫外光谱法中，SPFX-BSA的喹诺酮类部分的吸收峰已移到224 nm和292 nm（图3），这意味着 SPFX与 BSA的结合成功。包被抗原SPFX-OVA与SPFX-BSA具有相似的UV图谱。

如其他研究所述，当将氟喹诺酮的羧基连接到载体蛋白合成的免疫原制备抗体时，发现这些氟喹诺酮之间具有高交叉反应性[8，15]。用SPFX抗体的CR值、恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、环丙沙星等4种氟喹诺酮类药物的CR值评价该方法的特异性。

将已知量的SPFX添加到猪肉中，并使用缓冲液中制作的校准曲线进行分析。添加35、105和315 μg/L的猪肉样品的平均回收率分别为104、102和101（批内回收率）和106、104和102（批间）回收率。CV（变异系数）的范围分别为测定内的0.97%～5.68%和测定间的1.07%～5.51%。由于35 μg/L接近31 μg/L的检测限，因此需要更大的变异性和更低的准确度。用酶联免疫吸附试验（ELISA）对猪抽提液进行了一系列稀释，并比较了PBS缓冲液中的结果。提取液稀释1:10，抑制曲线与PBS缓冲液基本一致。缓冲溶液中的测试极限为31 Cg/L。采用SPFX的浓度检测限吸光度值降至无竞争吸光度值的90%。HPLC与icELISA的结果具有良好的一致性，进一步证实了icELISA的可靠性。

越来越多的国家已经制订了喹诺酮类药物的最大残留量（MRLs）和停药期，所以必须对样品进行常规监测以确保SPFX的正确使用。沈翠香等人[16]采用微生物抑制法来检测恩诺沙星药物残留，其处理方法简便，成本低的优点已经被许多企业所应用，但每组测试只能筛检一类药物，在初筛期间还会出现假阳性的结果，所以不能准确地进行兽药残留分析。万雄等人[17]采用HPLC法检测水产品中的司帕沙星残留，该方法检测结果精确、假阳性率低，但需对待测样品进行复杂的预处理，而且设备昂贵，在面对大量待测样品时就略显不足。

3 结论

本研究制备了一种特异性单克隆抗体，采用高灵敏度间接竞争酶联免疫吸附法测定动物性食品中的SPFX，IC50最低达到31 μg/L，目前没有抗体具有四种结构相关化合物和其他化合物。试验表明本研究中所建立的ELISA方法具备灵敏度高，特异性高，准确度高，易操作，相对于HPLC法更加快速、便捷，可用于动物性食品中SPFX残留的快速检测。