黄芪多糖对Tg诱导PERK/eIF2α通路介导HT29细胞凋亡的保护机制研究*

郑 烈 闻新丽 段盛蕾

（陕西省中医医院，陕西 西安 710003）

内质网（ER）作为细胞内最大的膜网络结构，具有完成蛋白质的合成及新生肽链的折叠、组装和运输的功能。肠上皮细胞受到病原微生物、炎性因子、缺血缺氧等多种应激因素后可引发内质网应激（ERS）［1-2］。有研究表明，ERS是溃疡性结肠炎（UC）发病的主要原因，过度ERS会损伤肠黏膜屏障，释放大量炎症因子［3-4］。黄芪多糖是从中药黄芪中分离提纯的大分子化合物，具有抗氧化应激、增强免疫功能等药理作用，可通过抑制肠上皮细胞发生ERS，减轻UC大鼠结肠黏膜的炎症反应［5-6］。人结肠癌细胞系HT29细胞与IECs具有相类似的生物学特征且较为容易培养获得，是国际公认的UC炎症细胞模型［7-8］。目前，关于UC通过毒胡萝卜素内酯（Tg）诱导人结肠癌系HT29细胞发生内质网应激引起细胞凋亡的报道较少。PERK/eIF2α通路是内质网应激途径中最常见的细胞凋亡途径［9］，是否通过PERK/eIF2α内质网应激在UC肠上皮细胞损害中发挥关键作用是值得研究的重要方向。因此，本研究探讨黄芪多糖对Tg诱导HT29细胞蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）蛋白及p-eIF2α蛋白表达的影响，从而进一步为黄芪多糖治疗UC提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 耗材与仪器 细胞培养瓶、培养板、冻存盒、冻存管（德国Eppendorf公司，产品货号：3102S，11865S），Millipore过滤器（瑞典Medicago公司），精密分析天平仪器，TC20TM全自动细胞计数仪（美国BIO-RAD公司），OLYMPUS显微镜（IX71、BX53型）等。

1.2 主要试剂 McCoys 5A培养基（美国GIBCO公司，货号：A1010）、DMSO（美国GIBCO公司，货号：D7126）、胰蛋白酶（美国GIBCO公司，货号：Y8925），引物合成（上海闪晶生物技术有限公司），BCA蛋白浓度试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：P0015L）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B）等。黄芪多糖（批号：151209，纯度＞75%，购买于上海融合生物科技有限公司），PBS tablets（瑞典Medicago公司），PERK、p-eIF2α抗体、二抗（抗兔）（美国Cell Signaling Technology，产品货号：3709S ，11888S），CHOP mRNA表达检测［天根生化科技（北京）有限公司］。

1.3 HT29细胞株培养 使用McCoys 5A完全培养液将HT29细胞培养在37℃、5% CO2培养箱中。培养液中含有10%胎牛血清、100 U/L青-链霉素和2.5 mg/mL两性霉素B，及时更换培养液和细胞传代。

1.4 黄芪多糖溶液配制 称取黄芪多糖干粉剂（天津赛诺制药有限公司，国药准字Z20040085）。DMSO溶解，过滤除菌器除菌，配制成1 mmol/L黄芪多糖溶液，然后稀释为终质量浓度分别为1、10 μg/mL的黄芪多糖溶液。

1.5 HT29细胞处理与分组 细胞分组为1）空白细胞组：采用McCoys 5A完全培养基培养，不用任何药物干预。2）模型组：采用1 μmol/L Tg诱导HT29细胞建立内质网应激模型［2］。3）黄芪多糖低剂量组（1 μmol/L+Tg 1 μg/mL）。4）黄芪多糖高剂量组（1 μmol/L+Tg 10 μg/mL）。

1.6 Western blotting法检测 HT29细胞 PERK、peIF2α、Caspase-3蛋白表达情况 HT-29通过1 μmol/L Tg诱导，给予不同剂量的黄芪多糖诱导24 h后，提取蛋白并定量分析。

1.7 Real-time PCR检测CHOP mRNA表达 提取细胞总RNA，采用2-ΔΔCt法计算目的基因CHOP mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0软件作图，数据分析采用SPSS23.0软件。对符合正态性检验和方差齐性检验的数据，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＞0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Tg诱导HT29细胞在不同时间PERK及p-eIF2α蛋白的表达 见图1，表2。HT29细胞采用McCoys 5A完全培养基培养后用 Tg诱导，在 0、12、24、48 h时PERK及p-eIF2α蛋白质水平随时间的延长呈依赖性增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 Tg诱导HT29细胞在不同时间PERK及p-eIF2α蛋白的表达比较（±s）

表2 Tg诱导HT29细胞在不同时间PERK及p-eIF2α蛋白的表达比较（±s）

注：与0 h比较，*P＜0.05；与12 h比较，**P＜0.05。下同。

时间0 h 12 h 24 h 48 h n 6 6 6 6 PERK/β-actin 0.03±0.01 0.07±0.02*1.01±0.13**1.34±0.36**p-eIF2α/β-actin 0.06±0.02 0.08±0.03*1.15±0.35**1.56±0.47**

2.2 各组HT29细胞CHOP mRNA表达比较 见表3。以β-actin为参照，与空白组比较，模型组CHOP mRNA表达明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪多糖低剂量组和黄芪多糖高剂量组CHOP mRNA表达均减少（P＜0.05）；与黄芪多糖低剂量组比较，黄芪多糖高剂量组CHOP mRNA表达减少（P＜0.05）。

表3 各组HT29细胞CHOP mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组HT29细胞CHOP mRNA表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与黄芪多糖低剂量组比较，▲P＜0.05。下同。

组别空白组模型组黄芪多糖低剂量组黄芪多糖高剂量组n 6 6 6 6 CHOP mRNA 1.00±0.15 7.64±0.38*5.36±0.47△2.39±0.32▲

2.3 各组HT29细胞PERK和p-eIF2α蛋白表达比较见图2，表4。与空白组比较，模型组PERK、p-eIF2α蛋白质表达明显增加（P＜0.01），通过不同浓度黄芪多糖干预后，PERK、p-eIF2α蛋白质表达呈下降趋势（P＜0.05或P＜0.01），且高剂量的黄芪多糖能显著抑制PERK、p-eIF2α蛋白质表达（P＜0.05）。

表4 各组HT29细胞PERK和p-eIF2α蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组HT29细胞PERK和p-eIF2α蛋白表达水平比较（±s）

注：与0 h比较，*P＜0.05；与12 h比较，**P＜0.05。下同。

时间空白组模型组黄芪多糖低剂量组黄芪多糖高剂量组n 6 6 6 6 PERK/β-actin 0.05±0.01 0.09±0.02*0.08±0.02△1.34±0.36**p-eIF2α/β-actin 0.02±0.01 0.05±0.01*0.04±0.02△1.56±0.47**

2.4 各组HT29细胞凋亡蛋白Caspase-3表达比较见表5。Tg诱导HT29细胞后明显增加Caspase-3的凋亡（P＜0.01），给予不同剂量黄芪多糖干预后HT29细胞Caspase-3的凋亡率较模型组下降（P＜0.05或P＜0.01），且高剂量黄芪多糖明显优于低剂量组（P＜0.05）。

表5 各组HT29细胞凋亡蛋白Caspase-3表达比较（±s）

表5 各组HT29细胞凋亡蛋白Caspase-3表达比较（±s）

组别n Caspase-3空白组模型组黄芪多糖低剂量组黄芪多糖高剂量组6 6 6 6 1.00±0.24 35.78±5.56*21.45±2.38**11.68±1.79***

3 讨 论

肠上皮细胞损伤是UC发病的主要原因。然而，内质网应激导致的肠上皮细胞损伤的确切分子机制尚不清楚。近年有研究表明［10-11］，内质网应激与UC发病关系密切，过度的内质网应激最终激活了肠上皮细胞的凋亡信号通路。前期研究表明［12］，Tg诱导HT29细胞后内质网结构发生明显异常，内质网大小、形态不同，多表现为空泡状结构，部分呈簇状改变。由此推测，ERS可引起细胞凋亡，但是通过何种机制发生凋亡目前尚未明确阐明。

国外学者研究表明［13-14］，ERS及其介导的信号通路，进而激发促炎因子级联释放、细胞凋亡途径及肠黏膜屏障功能障碍等病理生理变化，使肠黏膜受损，最终导致UC的发生发展。内质网应激时内质网腔内协助新生蛋白正确折叠的重要伴侣分子GRP78表达增加，与未折叠或错误蛋白结合，形成稳定的复合物，GRP78为内质网应激的标志蛋白。随着ERS持续严重时，内质网功能受损，可启动内质网相关凋亡程序，导致细胞死亡［15］。CHOP作为一种转录因子，在非应激情况下，为低水平表达，当ERS时，可通过诱导CHOP高转录，进而促进细胞凋亡［16］。Caspase在细胞凋亡中发挥重要作用，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶裂解，形成活化的Caspase，促进细胞凋亡，其中Caspase-3与凋亡关系密切［17-18］。内质网应激对于维持肠道平衡发挥重要作用，通过干预内质网应激来治疗溃疡性结肠炎，是中医药治疗UC的作用机制和治疗靶位的途径之一。黄芪多糖可以用来治疗UC，但其能否抑制Tg 诱导IECs的ERS目前报道较少［19-21］，因此具有重要研究价值和意义。

本课题以Tg诱导HT29细胞模拟UC时肠上皮细胞（IECs）发生ERS过程。结果发现：发生ERS时，HT29细胞内PERK及p-eIF2α蛋白质水平随时间的延长呈依赖性增加；而且细胞内CHOP mRNA的转录水平明显增加，对细胞凋亡有促进作用。通过黄芪多糖干预后，黄芪多糖随着剂量的增加PERK、p-eIF2α蛋白质表达呈下降趋势，且凋亡蛋白Caspase-3的凋亡率也明显下降，从而介导保护HT29细胞免于RES损伤，这可能是黄芪多糖治疗UC的IECs的潜在机制，并可能成为新的治疗靶点。

综上所述，这是一项全新的以Tg诱导HT29细胞模拟UC时IECs发生ERS过程的体外细胞研究，Tg可通过激活内质网应激PERK/e IF2α凋亡信号通路诱导IECs凋亡，这对Tg诱导的HT29细胞凋亡的分子生物学机制提出新的见解和开辟了新的研究思路，对临床医师探索寻找治疗UC的新药物提供依据。