肺腺癌中Ki-67表达与EGFR基因突变的相关性 及其在预后中的价值

潘 诚，李志华，徐文正，陈 亮

肺癌是我国发病及死亡人数最多的恶性肿瘤。其中，肺腺癌是肺癌主要病理亚型之一[1]。尽管薄层CT的普及使得更多早期肺癌病例得以发现，然而，我国肺癌患者总体5年生存率仍不足30%[2]。Ki-67由MKI67基因编码，其表达量的高低能够反映肿瘤细胞增殖能力。研究[3-4]表明，Ki-67表达与肿瘤大小、淋巴结转移以及肺癌患者预后相关。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变是肺癌最常见的基因突变之一[5]。既往已有数篇研究围绕Ki-67表达与EGFR突变的相关性展开。然而，研究结果并不一致，存在样本量低、分析简单、未进一步分析Ki-67蛋白联合EGFR突变在肺腺癌预后中的价值等不足。因此，该研究回顾性分析673例肺腺癌患者资料，探索Ki-67表达与EGFR基因突变的相关性，并揭示其在肺腺癌预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料回顾性筛选2014年1月-2020年4月于本院接受手术治疗的肺癌患者。主要纳入标准如下：①经组织病理学确诊的原发肺腺癌；②浸润性肺腺癌；③单发肺癌；④有明确的Ki-67蛋白表达及EGFR基因突变检测结果。

1.2 Ki-67蛋白表达及EGFR基因突变检测采用免疫组织化学检测肺腺癌组织中Ki-67蛋白表达(Ki-67抗体，ab92742，上海Abcam公司)。根据试剂盒说明书进行实验操作，采用DAB、苏木精进行染色。由经验丰富的病理科医师进行阅片，每张切片选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞(细胞核呈棕色颗粒)百分比。采用ADx-ARMS法或者PCR-Sanger法检测EGFR 18-21外显子突变情况。

1.3 统计学处理分别采用卡方检验、Student’st检验(或方差分析)比较分类变量、连续变量组间分布差异。采用斯皮尔曼等级相关(Spearman’s rho)评价Ki-67蛋白表达与EGFR基因突变相关性分析；采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析比较Ki-67表达、EGFR基因突变对肺腺癌患者预后的影响。所有统计分析均基于R (v3.6.0)及GraphPad Prism (v6.01)完成，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象临床病理特征本研究共纳入673例浸润性肺腺癌病例。其中，男性222例(32.99%)，女性451例(67.01%)。患者平均年龄(59.82±10.90)岁，平均肿瘤大小(19.24±9.94)mm。有76例(11.29%)患者出现淋巴结转移。研究对象具体临床病理特征见表1。

表1 研究对象基本特征

2.2 Ki-67表达与临床病理特征的相关性如表1所示，肺腺癌患者平均Ki-67表达为21.37±20.43(表达中位数15，四分位区间IQR: 6～30)既往对Ki-67表达高低分组标准并不统一，本研究分别以10和25为界对Ki-67表达进行分组：Ki-67 ≤ 10vsKi-67 > 10；Ki-67<25vsKi-67 ≥ 25。如表2所示，相较于女性(18.84±18.17)、非吸烟患者(19.62±19.02)，男性(26.51±23.61)、吸烟患者(29.89±24.60)Ki-67表达增高(P<0.001)。随着肿瘤大小增加，Ki-67表达逐渐升高(P<0.001)。并且，淋巴结转移样本中Ki-67表达高于未发生淋巴结转移患者(42.14±22.35vs18.73±18.59,P<0.001)。

2.3 EGFR基因突变与临床病理特征的相关性673例肺腺癌组织中，共有462例(68.65%)检测出EGFR突变。其中，外显子21突变234例(50.65%)，外显子19突变181例(39.18%)。如表3所示，相较于男性(突变率55.86%)、吸烟患者(突变率46.09%)，EGFR突变在女性(突变率74.94%)、非吸烟肺腺癌患者(突变率73.30%)中更常见 (P<0.001)。EGFR突变与肿瘤大小、淋巴结转移负相关(P<0.05)。在发生淋巴结转移的样本中EGFR突变率为56.58%，低于淋巴结阴性患者中的70.18%(P=0.023)。

2.4 Ki-67表达与EGFR基因突变的相关性如表2及表4所示，EGFR突变患者Ki-67表达低于EGFR野生型患者(18.82±17.75vs26.97±24.45,P<0.001)。Ki-67表达≥25的样本，EGFR突变率为57.0% (122/214)，低于Ki-67<25样本的74.1%(340/459)。同样，EGFR突变患者Ki-67表达>10的占比为50.9%，低于EGFR野生型患者(57.9%,P<0.001，表4)。发生19号外显子突变的样本(21.40±20.69)，其Ki-67表达略高于携带21号(17.31±15.42)或者其他外显子突变(16.37±15.34)的样本(P=0.041)。斯皮尔曼等级相关检验显示，Ki-67表达与EGFR基因突变存在较弱的负相关关联(rho=-0.129,P<0.001)。

2.5 Ki-67表达与EGFR突变在肺腺癌患者预后中的意义673例患者中，共有623例术后时间超过1年。中位随访时间为29.1月。随访期间，有15例患者死亡，43例发生肿瘤复发或转移。考虑到死亡病例有限，本实验采用无病生存期DFS(Disease-Free Survival)作为主要结局指标。如图1a所示，Ki-67>10的样本，其预后差于Ki-67≤10的样本；并且，随着Ki-67表达增高，效应值呈增大趋势。发生EGFR基因突变的样本，其预后较EGFR野生型患者更好(图1b)。联合Ki-67表达与EGFR基因突变可见：与Ki-67表达≤10并且携带EGFR突变的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者预后更差，且HR值达4.46(图1c)

表2 Ki-67表达与肺腺癌患者临床病理特征的相关性

表3 EGFR基因突变与临床病理特征的相关性[n(%)]

3 讨论

Ki-67表达及EGFR基因突变在肺腺癌进展及预后中发挥重要作用。然而，是否Ki-67表达与EGFR基因突变存在相关性，既往研究结论并不统一。通过回顾性分析673例肺腺癌患者临床病理资料，发现Ki-67表达与EGFR基因突变呈负相关，二者在肺腺癌预后中可能发挥联合作用。

此前研究表明,肺癌预后蛋白标志物与EGFR突变相关[6-7]。徐佳佳 等[8]在120例肺腺癌组织中检测Ki-67蛋白表达与EGFR突变情况，发现EGFR基因突变与Ki-67蛋白表达正相关；这一结果与孙宇 等[9]、张煜坤 等[10]发现一致。然而，韩义明 等[11]在291例NSCLC样本中发现Ki-67蛋白表达与EGFR突变无关，这一结果与金澄宇 等[12]、何锋 等[13]报道一致。值得注意的是，韩义明 等[11]发现EGFR基因突变率在Ki-67阴性组为59.0%，在Ki-67 阳性组为46.5%，P值为0.083，边缘阳性；类似地，金澄宇 等[12]在172例肺腺癌样本中发现EGFR在Ki-67阳性组突变率为36.8%，低于Ki-67阴性组的43.6%；而何峰 等[13]在140例肺腺癌中发现Ki-67表达与EGFR基因突变相关系数为-0.102，但P值大于0.05。由此可见，既往研究已经提示Ki-67表达可能与EGFR基因突变存在负相关关联，但由于样本量限制，差异未达统计学标准。此外，分析方法不同、Ki-67高低表达(阳性/阴性)划分标准不一等皆可能对研究结果产生影响。

表4 Ki-67表达与EGFR基因突变的相关性[n(%)]

图1 Ki-67表达与EGFR基因突变在肺腺癌患者预后中的价值

既往研究[4]表明，相较于鳞状细胞癌、大细胞癌等其他NSCLC病理亚型，肺腺癌中Ki-67表达更低。并且，浸润性肺腺癌Ki-67表达较微浸润腺癌、原位腺癌更高[14]。为了排除病理亚型及浸润深度对Ki-67表达的影响，本研究针对浸润性肺腺癌样本进行分析，显示Ki-67表达与EGFR基因突变负相关，在男性、吸烟患者中更高，与肿瘤大小、淋巴结转移正相关，这一结果与既往多项研究结果一致[4]。与Ki-67特征相反的是，EGFR突变率在女性、非吸烟肺腺癌患者中更高；且与肿瘤大小、淋巴结转移负相关。上述结果也从侧面提示：肺腺癌中，Ki-67表达与EGFR基因突变可能负相关。

生存分析结果表明，与Ki-67低表达肺腺癌患者相比，Ki-67高表达患者预后更差。而相较于EGFR野生型患者，发生EGFR突变的患者预后更好。分析Ki-67表达与EGFR基因突变显示：与Ki-67表达≤10并且携带EGFR突变的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者预后更差，HR值达4.46，提示临床应该重视这部分患者的预后。然而，肺腺癌中Ki-67表达与EGFR基因突变相关的潜在生物学机制尚有待阐明。

肺腺癌中，Ki-67表达与EGFR基因突变存在负相关关联。与Ki-67低表达并且发生EGFR突变的肺腺癌患者相比，Ki-67高表达并且EGFR野生型患者预后较差。Ki-67表达与EGFR基因突变在肺腺癌预后中可能发挥联合作用。