基于IKK/IκB/NF-κB信号通路探讨养心颗粒干预急性心肌梗死后心室重构的作用机制

姜芊竹，张 琪，杨建飞，万冬梅，孙 静，邢露茗，封 笑，周亚滨

近年来，随着我国人口结构的老龄化，心血管系统疾病的发病率日益升高，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)由于发病急、预后差，严重危害中老年人群的健康。冠状动脉粥样斑块破裂形成血栓或者血管痉挛致使冠状动脉闭阻，相应血管的供血区心肌出现持续性的缺血而导致AMI的发生[1]。随着诊疗水平的提高和病人健康意识的增强，近10年来AMI急性期住院病人的死亡率大幅下降，但AMI急性期过后的心室重构严重影响病人的预后，表现为梗死区域的心肌厚度及张力下降，非梗死区域的心肌肥厚扩张，心室腔内形态发生改变，进而影响心室的收缩功能，随之引发心律失常、心力衰竭等[2]。因此，AMI急性期过后对抗心室重构的治疗就显得十分重要。

中医在治疗AMI及其并发症中积累了大量的临床经验，具有独特的疗效，安全性较好的优势。研究报道，养心颗粒具有明确的治疗不稳定型心绞痛的作用[3]。本课题组前期研究表明，养心颗粒可以通过保护心肌细胞、抑制炎性因子的表达来改善心力衰竭大鼠的心肌功能[4]。本研究探讨养心颗粒对抗AMI后心室重构的作用，并通过抑制性核因子激酶κB(IKK)/磷酸化IκB(p-IκB)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠60只，6～8月龄，体重(250±10)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(黑)2016004。饲养环境：早晚明暗自动切换(07：00～19：00)，独立通风换气系统，相对湿度40%～70%，温度(24±2)℃。

1.2 实验药物 养心颗粒粉末，由黑龙江省药材公司提供，组成(13味)：黄芪、人参、白茯苓、当归、半夏、川芎、酸枣仁、远志、茯神、辣桂、五味子、柏子仁、炙甘草，每克粉末含生药量7 g，以蒸馏水配制成0.4 g/mL药液，2～8 ℃冷藏保存。马来酸依那普利片，由扬子江药业集团江苏制药股份有限公司提供(批准文号：H32026568)。

1.3 实验试剂 大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附试剂盒(森贝伽生物公司)；兔抗大鼠NF-κB p65、IKK、核因子κB抑制剂(IκB-α)、p-IκBα-抗(Abcam公司)；Trizol(Ambion公司，批号：135306)。

1.4 实验仪器 酶标仪(美国Awareness公司，型号：Stat Fax-2100)；数字凝胶成像系统(美国Alpha公司，型号：ALPHA1000-2)；光学显微镜(日本Nikon公司，型号：YS100)；动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：R419智能型)；超薄切片机(德国Lecia公司，型号：RM2135)；多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心，型号：CMIA-008)；多道生理记录仪(普升科技有限公司，型号：MP-160)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组及模型复制 将60只SD大鼠，按照体质量随机分为假手术组(12只)和手术组(48只)，手术组大鼠按照如下方法复制大鼠AMI模型：腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后，采用多道生理记录仪监测大鼠心电图(ECG)，剔除ECG不正常者。将大鼠仰卧位固定于手术台上，经口进行气管插管，连接智能呼吸机，呼吸频率90次/min，呼吸气量比1∶1，潮气量4～6 mL。用剃毛剪刀清理大鼠左侧胸部毛，剪开皮肤，用止血钳固定，钝性剥离左侧第3肋～第4肋间肌肉，胸腔开2 cm左右小口，轻轻按压右侧胸肋骨，暴露出心脏，钝性剥离心包膜，在左心耳与肺动脉圆锥左下缘处(左心耳下2～3 cm)进针(3×8弧形针)，用医用6-0号手术线结扎冠状动脉左前降支(LAD)。假手术组大鼠只穿线、不结扎[5]。将大鼠心脏放回胸腔，逐层缝合肌肉层，并用负压管抽尽胸腔内空气，以免造成气胸。缝合毛皮层。以大鼠结扎后ECG中S-T段抬高(产生J点位移)或者倒置为模型复制成功的标志。术后腹腔注射青霉素2×105U/d，连续3 d，以预防胸腔感染。

本研究假手术组12只实验动物全部存活。手术组模型复制成功且术后存活的大鼠共36只，随机分为模型组、养心颗粒组、依那普利组，每组12只。

1.5.2 给药方法 模型复制成功后24 h内，养心颗粒组大鼠每日灌胃养心颗粒12.07 g/kg(分早、晚2次给药)；依那普利组每日灌胃依那普利混悬液10 mg/kg；模型组和假手术组灌胃等体积的生理盐水。连续给药8周。

1.6 观察指标

1.6.1 苏木精-伊红(HE)染色法观察大鼠心肌组织病理变化 取实验大鼠外周血后，立即脱颈处死，迅速开胸暴露心脏，取左心室梗死周围心肌组织，4%多聚甲醛固定，用10%的EDTA脱钙处理，梯度浓度乙醇脱水处理后用石蜡包埋，切片后HE染色，封片，光镜下观察各组大鼠心肌组织的病理学改变。

1.6.2 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清MMP-2及TIMP-2的含量 于末次给药后3 h用毛细管引流眼底静脉丛取静脉血1 mL，静置15 min后，低温离心10 min(3 000 r/min)，取上层血清，采用ELISA法测定MMP-2及TIMP-2含量。

1.6.3 ELISA法测定大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFN-γ的含量 取各组大鼠梗死部位心肌组织，精密称量0.1 g，加入0.5 mL无菌生理盐水，在冰浴上低温匀浆3 min，匀浆液低温离心10 min(3 000 r/min)，取上清液，采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量。

1.6.4 蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定大鼠心肌组织NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白的表达 取梗死心肌组织，精密称量0.2 g，-80 ℃低温保存。将低温保存的大鼠心肌组织粉碎后，在液氮中研磨，加入细胞裂解液(Trizol)提取蛋白。加入等体积缓冲液，经10%SDS-PAGE电泳(蛋白上样量为50 μg)后，恒流电转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，Tbs-Tween漂洗，加入5%的脱脂奶粉避光封闭1 h，Tbs-Tween漂洗3次，加入一抗(NF-κBp65、IKK-β、IκB-α、p-IκBα，1∶1 000)，4 ℃恒温过夜。次日08：00用Tbs-Tween漂洗3次后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 500)，室温温育1 h，反复漂洗3次后，加入ECL，暗室曝光后进行光密度扫描，分析条带分子量及灰度值(β-actin为内参蛋白)。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理变化 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核明显，无形态改变及炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，出现形态的改变，表现为伸长、肿胀甚至是坏死，电镜下可见水肿和炎性细胞浸润，细胞间可见胶原纤维增生；养心颗粒组和依那普利组大鼠心肌细胞排列整齐度有所改善，肿胀和变形有所减轻，胶原纤维增生和炎性细胞浸润减少。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠外周血MMP-2明显升高，TIMP-2明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，养心颗粒组和依那普利组大鼠外周血MMP-2明显下降，TIMP-2明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；养心颗粒组与依那普利组大鼠外周血MMP-2、TIMP-2比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比较 (±s) 单位：ng/mL

2.3 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量变化 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，养心颗粒组和依那普利组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；养心颗粒组与依那普利组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量比较 (±s) 单位：pg/mL

2.4 养心颗粒对大鼠心肌组织NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NF-κBp65和p-IκBα蛋白相对表达均明显升高，IKK-β和IκB-α蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，养心颗粒组和依那普利组大鼠心肌组织NF-κBp65和p-IκBα蛋白相对表达均明显降低，IKK-β和IκB-α蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；养心颗粒组与依那普利组大鼠心肌组织NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图2、表3。

图2 各组心肌细胞NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表达条带图

表3 各组大鼠心肌组织NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表达比较 (±s) 单位：ng/mL

3 讨 论

心室重构是慢性心力衰竭的主要病理基础。心室长期负荷过重，心肌收缩与舒张功能下降，不能维系正常的心排血量，导致心室发生代偿性形态的改变[6]。大量研究表明，中药复方可以通过多靶点、多信号通路改善梗死后的心室重构[7-8]。《金匮要略》中最早对此提出了“胸痹”“心水”“支饮”的概念，根据本课题组的临床经验，心室重构的病人多见气虚血瘀，其次为气阴两虚，少见痰阻血瘀证、气滞血瘀证和阳虚水泛证。根据心神失养、气虚血瘀的病机，周亚滨教授拟方养心颗粒用于临床多年，疗效及安全性颇佳[9]。

养心颗粒基础方来源于《证治准绳·杂病证治类方》之养心汤，由养心安神药与补气活血药组成，主治心虚血少、惊惕不宁。方中人参、黄芪为君药，人参定志安神、益肺补脾，黄芪益卫固表、补气升阳。臣药为白茯苓、茯神、川芎和当归。白茯苓与茯神两药合用宁心安神；川芎行气活血、止痛祛风，当归补血活血，两药合用补血养心。佐为远志、半夏、五味子、辣桂、酸枣仁、柏子仁。远志可安神宁心、祛痰开窍；半夏燥湿化痰，以散扰心之痰涎；五味子生津敛汗、安神宁心，以收摄耗散之心气；辣桂助阳补心，加强补气之功效，可引诸药入心经；酸枣仁、柏子仁两药合用安神养心、补敛心气。使药为炙甘草，可和胃补脾，益气复脉，奏补土养心之效，助参芪成益气之功。

心肌组织细胞外基质降解在心室重构过程中扮演着重要角色。MMP-2是MMPs家族重要的成员之一，是能特异性地使细胞外基质降解的蛋白水解酶，TIMP-2可抑制MMP-2的活性，进而降低心肌组织细胞外基质的降解[10-12]。因此，MMP-2/TIMP-2存在一个动态的平衡，这个动态的平衡对维持心肌组织的完整结构和稳态内环境具有重要的生理意义[13]。本研究结果表明，养心颗粒可以明显降低细胞外基质的降解，部分恢复心室重构过程中MMP-2/TIMP-2的失衡。

炎症反应是AMI后心室重构的发病机制中的关键环节[14]。炎性细胞因子受到细胞内外环境改变的刺激而激活后，促进下游炎性信号通路的启动与传导，进而诱导心室重构的发生与发展[15]。TNF-α、白细胞介素类(ILs)等炎性细胞因子在心肌组织中的大量堆积，会降低心肌收缩力，并能导致心肌组织血管内皮的损伤，使流经心肌组织的血液处于高凝状态。由此可见，此类炎性因子在心肌组织中蓄积水平是衡量心室重构严重程度的重要客观指标。与此同时抑制炎性反应也是心室重构的主要治疗手段之一[16]。

IKK/IκB/NF-κB信号通路介导了AMI后心肌细胞的炎症反应和凋亡，是梗死后心室重构逐渐形成过程中的主要发病机制[17]。NF-κB是一类心肌细胞内具有多项转录功能的蛋白，其中NF-κBp65是其主要的活性形式。生理状态下，IκB与NF-κBp65在胞浆中结合成无活性的三聚体[18]。AMI发病后，刺激信号由心肌细胞外的IKK介导，活化的IKK复合物使IκB分子N端第32位和第36位的Ser磷酸化，导致IκB的分子结构改变，p-IκB与NF-κB p65的三聚体解离，释放出游离的NF-κB p65进入心肌细胞核调控多个炎性相关靶基因的转录[19]。同时，细胞核内促炎性基因的高表达，进一步促进了相关炎性因子(如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)的合成和释放，导致心肌组织进一步损伤，这就形成了炎性因子激活和核内转录的恶性循环。因此，多靶点治疗抑制心肌细胞炎性连锁反应对抗心室重构的治疗就显得格外重要，这也是中医药多靶点起效的优势所在[20]。

本实验结果得出，养心颗粒可以通过降低心肌组织的炎性细胞因子水平同时抑制IKK/IκB/NF-κB信号的传递来缓解AMI后的心室重构，其作用效果与依那普利相当。