缺血性脑卒中特征性不饱和脂肪酸的分析

李娟，鞠洁旸，涂烨玲，孙高慧，张鹏，高俊风，吴晋

脑卒中是威胁人类健康的重要疾病之一，致死率、致残率高[1-2]，其中缺血性脑卒中占比更高。动脉粥样硬化是缺血性脑卒中重要致病因素，而不饱和脂肪酸，特别是ω-3族不饱和脂肪酸可以减缓动脉粥样硬化的发展，在冠心病相关多项研究[3-4]中已经被证实。然而各类不饱和脂肪酸与缺血性脑卒中的关联研究较少，且结果不一致。有研究[5]发现，总的不饱和脂肪酸水平升高是缺血性脑卒中发病的高危因素之一。国内研究[6-7]发现，急性脑梗死患者CSF游离脂肪酸水平与血清中游离脂肪酸水平及病灶体积呈正相关，是急性脑梗死的独立预后指标。但也有部分研究[8-9]未发现特定脂肪酸与缺血性脑卒中有显著关联。这些结果不一致可能与研究的脂肪酸种类有差异有关，既往研究大多仅区分了ω-3族、ω-6族或单不饱和脂肪酸等大类，未充分考虑不饱和脂肪酸谱中不同种类的生物学效应，如二十二碳六烯酸(DHA)对脑梗死有显著保护性作用[10]，所以对脂肪酸谱系深入研究有助于理解其与脑卒中的关系。本研究采用液相色谱串联质谱技术检测急性缺血性脑卒中患者血清不饱和脂肪酸谱水平，通过与慢性脑卒中和非卒中患者比较，以期找到缺血性脑卒中特征性不饱和脂肪酸谱，为缺血性脑卒中的防治提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)卒中组：系2019年1月至2021年3月在南京医科大学第二附属医院神经内科住院治疗的急性缺血性脑卒中患者71例。男性46例，女性25例；年龄60～88岁，平均(65.47±12.02)岁。根据病程将患者分为急性缺血性脑卒中亚组(急性亚组)40例及慢性缺血性脑卒中亚组(慢性亚组)31例。①急性亚组(病程≤30 d)：男性28例，女性12例；年龄62～88岁，平均(66.15±11.99)岁；病程0.5 h至14 d，平均(5.00±6.53)d。糖尿病11例，高血压22例。②慢性亚组(病程>30 d)：男性18例，女性13例；年龄60～85岁，平均(64.61±12.38)岁；病程31 d至4年，平均(1.65±2.35)年。糖尿病9例，高血压16例。(2)对照组：系同期住院的非脑卒中患者93例。男性55例，女性38例；糖尿病21例，高血压41例，年龄50～86岁，平均(60.59±10.62)岁。各组间年龄、性别、基础疾病差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。所有研究对象未接受脂肪酸相关制剂及药物治疗，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 不饱和脂肪酸谱的检测 于入院次日采集研究对象的静脉血5 ml，采用液相色谱串联质谱法进行检测。检测设备为AB SCIEX公司API 3200液相色谱串联质谱系统，检测试剂采用不饱和脂肪酸谱检测试剂盒(江苏豪思生物科技有限公司)，检测项目包括十六碳一烯酸(C16∶1)、十八碳一烯酸(C18∶1)、十八碳二烯酸(C18∶2)、α-十八碳三烯酸(α-C18∶3)、γ-十八碳三烯酸(γ-C18∶3)、二十碳一烯酸(C20∶1)、二十碳四烯酸(C20∶4)、二十碳五烯酸(C20∶5)、ω-3-二十二碳五烯酸(ω-3-C22∶5)、ω-6-二十二碳五烯酸(ω-6-C22∶5)、DHA(C22∶6)。计算这些脂肪酸中ω-6族(C18∶2，γ-C18∶3，C20∶4，ω-6-C22∶5)与ω-3族(α-C18∶3，ω-3-C22∶5，C20∶5，C22∶6)的比值(ω-6/ω-3)。单项不饱和脂肪酸参考范围以试剂盒说明书为准；ω-6/ω-3以4～10为适宜状态[11]，以4、6、10作为截断值。

1.2.2 统计学方法 使用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料呈偏态分布，以中位数(M)和四分位数(Q25，Q75)表示，两组间比较使用Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组不饱和脂肪酸水平的比较 见表1、2。与对照组比较，卒中组及急性亚组血清C18∶2水平显著降低(Z=-1.990，Z=-2.559；均P<0.05)，余不饱和脂肪酸水平及ω-6/ω-3差异无统计学意义(均P>0.05)，慢性亚组各不饱和脂肪酸水平及ω-6/ω-3差异均无统计学意义(均P>0.05)。与慢性亚组比较比较，急性亚组ω-6-C22∶5与C22∶6水平显著降低(Z=-2.064，Z=-2.603；均P<0.05)，其余不饱和脂肪酸水平及ω-6/ω-3差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 卒中组与对照组不饱和脂肪酸水平的比较[M(Q25,Q75),μmol/L]组别例数C16∶1C18∶1C18∶2α-C18∶3γ-C18∶3C20∶1卒中组7115.90(7.69,23.30)245.00(188.00,333.00)243.00(166.00,293.00)11.30(7.84,15.60)2.43(1.63,3.28)2.40(1.82,3.28)对照组9315.60(11.00,23.80)257.00(182.50,361.50)269.00(196.00,346.50)11.60(7.89,17.40)2.35(1.68,3.40)2.44(1.77,3.47)Z值-0.423-0.680-1.990-0.441-0.076-0.116P值0.6720.496<0.0500.6590.9390.908组别例数C20∶4C20∶5ω-3-C22∶5ω-6-C22∶5C22∶6ω6/ω3卒中组7143.00(33.00,59.20)2.11(1.58,3.30)2.90(2.23,4.04)2.24(1.52,2.96)17.30(13.80,22.60)7.80(5.99,10.01)对照组9343.10(33.05,61.00)2.28(1.51,3.56)3.21(2.31,5.18)2.09(1.43,3.00)19.50(13.45,28.60)8.15(6.97,9.59)Z值-0.159-0.173-1.079-0.076-0.868-1.180P值0.8730.8630.2810.9390.3850.238

表2 急性亚组与慢性亚组不饱和脂肪酸水平的比较[M(Q25,Q75),μmol/L]组别例数C16∶1C18∶1C18∶2α-C18∶3γ-C18∶3C20∶1急性亚组4014.5(7.90,21.10)237.50(176.25,301.50)226.00(140.25,286.00)10.90(7.87,13.98)2.14(1.60,3.11)2.62(2.15,3.08)慢性亚组3118.60(7.62,35.90)254.00(188.00,354.00)258.00(194.00,329.00)11.50(7.47,21.60)2.93(1.68,3.32)2.25(1.72,4.39)Z值-1.177-1.136-1.739-1.385-1.478-0.916P值0.2390.2560.0820.1660.1390.360组别例数C20∶4C20∶5ω-3-C22∶5ω-6-C22∶5C22∶6ω6/ω3急性亚组4041.65(29.38,55.53)2.13(1.58,2.88)2.87(2.16,3.68)1.97(1.13,2.65)16.05(11.70,21.38)7.86(5.99,10.38)慢性亚组3146.20(36.40,64.70)2.05(1.56,4.54)3.58(2.52,5.47)2.45(1.81,3.13)19.20(15.20,26.60)7.80(5.75,9.27)Z值-1.525-0.626-1.583-2.064-2.603-0.348P值0.1270.5310.114<0.050<0.0500.728

2.2 各组不同范围ω-6/ω-3的比较 见表3。本组无ω-6/ω-3<4的样本，故未进行分析。以6为截断值时，卒中组与对照组、急性亚组与对照组、慢性亚组与对照组ω-6/ω-3差异有统计学意义(χ2=26.484，P<0.05；χ2=25.140，P<0.05；χ2=25.655，P<0.05)，急性亚组与慢性亚组ω-6/ω-3差异无统计学意义(χ2=0.006，P=0.938)。以10为截断值时，急性亚组与对照组ω-6/ω-3差异有统计学意义(χ2=3.973，P<0.05)，卒中组与对照组、急性亚组与慢性亚组、慢性亚组与对照组差异无统计学意义(χ2=2.719，P=0.099；χ2=1.046，P=0.306；χ2=0.318，P=0.573)。

表3 各组不同适宜状态ω-6/ω-3的比率[例(%)]组别例数<4≥4<6≥6<10≥10卒中组71071(100.00)18(25.35)53(74.65)53(74.65)18(25.35) 急性亚组040(100.00)10(25.00)30(75.00)28(70.00)12(30.00) 慢性亚组031(100.00)8(25.81)23(74.19)25(80.65)6(19.35)对照组93093(100.00)093(100.00)79(84.95)14(15.05)

3 讨 论

动脉粥样硬化是缺血性脑卒中的重要危险因素，既往研究从影响动脉粥样硬化形成的多种检测指标着手，探索对脑卒中疾病间的关联。脂肪酸是脂肪代谢中间产物，其代谢速度快，可以动态监测体内脂代谢水平，与动脉粥样硬化发展有密切关联，所以常被用于脑卒中研究。但也有一部分学者[12]认为脂肪酸谱由不同种类的脂肪酸组成，不同的脂肪酸对脑卒中的影响有差异，故脂肪酸与脑卒中无关。随着检验技术的发展，目前可以采用液相色谱串联质谱技术对游离脂肪酸进行分析检测，进而测定脂肪酸谱系化合物浓度。本研究通过分析缺血性脑卒中患者血清不饱和脂肪酸谱浓度变化，旨在找到缺血性脑卒中患者的特征性不饱和脂肪酸谱。

本研究发现一种ω-6族不饱和脂肪酸——C18∶2在缺血性脑卒中患者中，特别是急性缺血性脑卒中患者中含量低于非脑卒中人群，与既往研究[13]结果一致。作为饮食中最主要的ω-6族不饱和脂肪酸，C18∶2水平增加在心脑血管疾病中被认为是一种保护性因素。近期一项大型多国协作的前瞻性研究[14]发现，体内较高的C18∶2水平与较低的心血管病发病率、心血管疾病死亡率和缺血性卒中风险显著相关。国内一项研究[15]发现，急性缺血性脑卒中患者的血浆C18∶2水平显著低于非脑卒中患者，且随着血浆C18∶2水平的升高，急性缺血性脑卒中的发病风险逐步降低，与本研究结果一致。C18∶2改善心脑血管疾病的机制尚未完全明确。一项测定载脂蛋白E(ApoE)基因多态性的Meta分析[16]发现，携带ApoE ε4基因型患者体内C18∶2含量与全因脑卒中、缺血性脑卒中和全因死亡率呈负相关，其中每提高一个标准差的C18∶2含量，缺血性脑卒中的风险降低了52%，而非携带者群体没有发现差异。这提示C18∶2可以通过调节血脂代谢减少缺血性脑卒中的发生，并且受到脂代谢相关基因的调控。本研究还发现，慢性缺血性脑卒中亚组与对照组C18∶2水平没有显著性差异，提示脑血管疾病处于慢性阶段或进展性阶段时，体内可代偿性地提高C18∶2的水平，改善脂代谢，从而减缓病程。此时如果能够适时补充C18∶2，可能会降低缺血性脑卒中的发生风险。在丹麦一项营养素摄入评估[17]中，使用C18∶2代替饱和脂肪酸、碳水化合物或单不饱和脂肪酸，可以显著降低缺血性脑卒中的风险。

除了ω-6族与心脑血管疾病间的关联，更多不饱和脂肪酸谱的研究重点在ω-3族上。上世纪八十年代，通过心血管疾病的研究[18-20]让ω-3族不饱和脂肪酸为人熟知，在缺血性脑卒中研究[21]中也发现了类似的结果。有研究[22]发现，与较低水平的DHA、C22∶5群体比较，血清较高水平DHA、C22∶5人群的缺血性脑卒中发病率更低；亚型分析中，仅有DHA与动脉粥样硬化性脑卒中相关。有趣的是，本研究发现DHA在急性脑卒中和慢性脑卒中两组间的显著性差异，且急性脑卒中患者的DHA水平更低，与既往研究[23]结果相近，但这种差异未在急性脑卒中与非脑卒中患者群体间被发现。近期国外一项大规模饮食与健康研究[24]也发现DHA的脂肪组织含量与缺血性脑卒中总发生率间没有相关性。故DHA与缺血性脑卒中间的关联尚待进一步研究。而从机制角度出发，多种神经损伤模型，包括脑缺血再灌注损伤模型的研究表明，DHA可以通过诱导抗氧化酶活性、增强抗氧化能力减少梗死面积[25]；DHA也可以减少卒中过程中炎症因子引发的炎症反应[26]，缓解脑缺血诱发的氧化应激反应[27]，诱导细胞自噬[28]，进而对梗死后的大脑进行保护。

ω-6族与ω-3族同为不饱和脂肪酸，体内代谢途径所需酶类为同一酶系，存在竞争性抑制，故两者的动态平衡在心脑血管疾病的发生与发展中具有重要意义。基础研究[29]发现，较低的ω-6/ω-3有助于改善脂代谢、炎症水平、氧化应激水平和血管内皮功能，从而降低心脑血管疾病风险。ω-6/ω-3降低到什么程度适宜呢？心血管疾病相关研究[30]认为，ω-6/ω-3处于4∶1～10∶1时，可以有效地减少包括心肌梗死在内各类心脏病的发生。我国营养指南[31]推荐ω-6/ω-3摄入比例为4～6∶1。国内的脑卒中患者膳食指导[31]提出，ω-3多不饱和脂肪酸摄入量应占总能量的0.5%～2%，ω-6多不饱和脂肪酸摄入量应占总能量的2.5%～9%，换算摄入比例在1∶4.5～5之间。参考这些适宜比值水平，本研究将截断值设置为4、6和10，分析脑卒中与非脑卒中人群间差异。结果发现，全样本总体比值水平控制一般，处于<6比值水平时，脑卒中患者有更多数量处于较为理想的ω-6/ω-3水平；<10时，仅急性缺血性脑卒中亚组与对照组间产生显著差异。这提示脑卒中患者，特别是在急性期存在代偿性的ω-6/ω-3降低，但尚未达到理想比值水平。

本研究初步探索缺血性脑卒中患者的不饱和脂肪酸谱的浓度水平，发现了C18∶2、DHA、ω-6/ω-3为主的特征性改变。但脂肪酸是可以通过日常饮食摄入的，处于一个动态变化的平衡状态，故下一步计划观察其动态变化的情况，以便深入解释缺血性脑卒中发生发展过程中不饱和脂肪酸谱变化的临床意义。