甘草查尔酮A对LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞炎性反应的抑制作用

田梦悦，贾 丽，梁艳艳，李 可，侯铭源，马玉忠 (河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001)

奶牛蹄叶炎是目前牧场最为棘手的常发病之一，可导致奶牛跛行、产奶量下降等，增加奶牛淘汰风险，造成巨大的经济损失[1]，而目前尚未找到有效防治蹄叶炎方法。在我国，应用中草药来治疗动物疾病的历史已达数千年之久，中草药资源丰富，且具有耐药性低及副作用小的优点，因此，筛选合适的中药用于治疗蹄叶炎，具有十分重要的意义

甘草是豆科植物甘草属，药用部位为干燥根和根茎，是临床常用药，有补中益气、清热解毒、调理阴阳等功效。甘草查尔酮A是从甘草中分离出的主要黄酮类化合物之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗寄生虫等多种功效[2-3]。然而，甘草查尔酮A对于奶牛蹄真皮炎性细胞的作用尚未见报道。本研究通过探讨甘草查尔酮A对于脂多糖(LPS)诱导的奶牛蹄真皮炎性细胞的影响，为奶牛蹄叶炎的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青有限公司；LPS购自Sigma公司；CCK-8试剂盒、RIPA高效裂解液购自Solarbio公司；牛TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自北京冬歌博业生物科技公司；SOD、MDA试剂盒购自南京建成试剂公司；p65 NF-κB、p-p65 NF-κB，IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 奶牛蹄真皮细胞的原代培养无菌条件下取奶牛蹄部皮肤组织，将其修剪成约1 cm3小块，浸泡于0.25%胰酶溶液中，4℃孵育过夜。取出组织块，PBS冲洗3次后，将真皮组织修剪成约0.5 cm3小块，铺至6孔细胞培养板中，缓慢加入约500 μL 含15%血清的DMEM培养基，置于CO2培养箱中培养12～24 h。次日，每孔加入2 mL 含15%血清的DMEM培养基。每周换液2次。当细胞约有50%融合时，将组织块取出。

1.3 细胞活力检测将奶牛蹄真皮细胞以1.0×105个/孔的密度接种于96孔板中，37℃ 5% CO2条件下培养过夜。将细胞分为6组，用0，1，5，10，50，100 mg/L 甘草查尔酮A处理后，37℃ 5% CO2条件下培养24,48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液。37℃孵育1 h后，测定各孔D450值，计算细胞活力。

1.4 细胞分组处理将奶牛蹄真皮细胞分为5组，对照组：DMEM培养基常规培养；模型组：10 mg/L LPS处理；药物处理组：10 mg/L LPS处理24 h后，10，50，100 mg/L甘草查尔酮A处理24 h。

1.5 TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、SOD、MDA水平检测按照ELISA试剂盒说明书要求，检测各组细胞上清液中TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量；按照说明书操作检测细胞上清液中SOD、MDA含量。

1.6 Western blot法检测MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白的表达RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后，12%SDS-PAGE电泳，半干法转膜，5%脱脂乳封闭1 h，一抗4℃过夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜，NBT/BCIP显色。

2 结果

2.1 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮细胞活力的影响结果显示，1，5，10，50，100 mg/L甘草查尔酮A处理24，48 h 对蹄真皮细胞活力均无显著性影响(P>0.05)(图1)。

图1 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮细胞活力的影响

2.2 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮炎性细胞TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量的影响ELISA结果表明，与对照组相比，10 mg/L LPS处理后，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量均极显著升高(P<0.01)。而用10，50，100 mg/L 甘草查尔酮A处理后，与LPS模型组相比，均可极显著降低TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量(P<0.01)(图2)。

注：##.与对照组比差异极显著(P<0.01)；**.与对照组比差异极显著(P<0.01)。下同

2.3 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮炎性细胞SOD、MDA含量的影响与对照组相比，10 mg/L LPS处理后，极显著降低SOD活力(P<0.01)，提高MDA含量(P<0.01)。与LPS模型组相比，10，50，100 mg/L甘草查尔酮A处理后，极显著提高SOD活力(P<0.01)，降低MDA含量(P<0.01)，且呈现一定的质量浓度依赖性(图3)。

图3 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮细胞SOD、MDA含量的影响

2.4 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮炎性细胞MAPKs和NF-κB信号通路的影响与对照组相比，10 mg/L LPS极显著地提高了ERK、JNK、p38、IκBα、p65蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。与LPS模型组相比，10，50，100 mg/L甘草查尔酮A均可极显著降低ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，甘草查尔酮A可显著(10 mg/L，P<0.05)或极显著(50，100 mg/L，P<0.01)降低IκBα蛋白的磷酸化水平，甘草查尔酮A可显著(100 mg/L，P<0.05)或极显著(50 mg/L，P<0.01)降低p65蛋白的磷酸化水平。

图4 甘草查尔酮A对奶牛蹄真皮细胞MAPK、NF-κB信号通路的影响

3 讨论

目前，奶牛蹄叶炎的治疗措施主要为对症治疗，减轻患部疼痛，但缺点在于治标不治本。另外，地塞米松以及许多抗生素可用于缓解全身炎症，莫能菌素、泰乐菌素等瘤胃改良剂可以用于减轻蹄叶炎的严重程度并延缓其发病[4-5]，但存在抗生素滥用的现象，容易引发食品安全问题，导致耐药菌株出现。而中药由于耐药性低、副作用小，已成为各种疾病的饲料补充剂或替代药物的潜在来源[6]。所以，研究中草药对奶牛蹄叶炎的治疗作用具有十分重要的意义。

本实验室前期试验显示，10 mg/L LPS作用24 h 可降低奶牛蹄真皮细胞活力，提高TNF-ɑ、IL-1β含量，成功建立奶牛蹄真皮炎性细胞模型[7]。细胞因子的过度产生与炎症损伤密切相关[8]。TNF-α、IL-1β和IL-6是典型的促炎细胞因子，在炎症反应的发病过程中发挥着极为关键的作用[9]。炎性因子的减少可以作为炎症减轻的重要信号。本试验中，甘草查尔酮A处理后，可显著降低TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量，表明甘草查尔酮A对于LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞炎性反应具有一定的抑制作用。

炎症和氧化应激是两个密切相关的病理过程，一方面，炎症细胞可产生多种可溶性介质并激活信号转导级联反应，从而导致氧化应激加剧[10]。另外，氧化应激可通过激活信号通路的启动而引起生物大分子损伤，并可引起炎症反应[11]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量是检测脂质过氧化和细胞氧化应激损伤的重要指标[12]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是机体重要的抗氧化酶，检测SOD的活力可用于反映机体自身清除自由基的能力大小[13]。本试验中，甘草查尔酮A可提高SOD活性并降低MDA含量，表明甘草查尔酮A可缓解LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞氧化应激损伤。

MAPK(mitogen-activated protein kinases)是将细胞表面的刺激信号传递入细胞核内的重要蛋白激酶，是多条信号通路的交汇中心，在早期炎症反应和NF-κB通路的激活中发挥着关键的作用[14]。MAPK家族包括ERK、JNK、p38三大类亚族[15]。其中，ERK的活化是刺激信号进入细胞核的关键步骤之一，可导致TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的分泌，以及iNOS表达上调[16]。JNK家族是诱导细胞信号转导的关键分子，可结合c-Jun的氨基末端，促使转录因子AP-1的磷酸化，参与免疫调控，调节炎症因子的分泌[17]。p38参与细胞凋亡、应激反应等生理病理过程，另外，p38还可被LPS等多种因素激活，介导炎症反应，参与调控TNF-α、IL-1、IL-6、TGF-β1等炎症细胞因子的生成与活化，因此，p38也成为了抗炎药物开发的关键靶点之一[18]。本试验中，甘草查尔酮A处理细胞后，ERK、JNK、p38蛋白磷酸化程度受到抑制，表明甘草查尔酮A对于LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞炎性损伤的抑制作用可能与MAPK信号通路有关。

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，是一种核转录因子，异二聚体p50-p65是其在机体内常见的存在形式[19]。NF-κB广泛存在于多种细胞中，是体内多条信号通路的交汇中心，参与细胞功能的调节，包括细胞增殖、凋亡、应激反应等，在促炎基因的调节方面起着至关重要的作用[20]。在非刺激状态下，NF-κB位于细胞质中，由于与抑制蛋白IκB结合，NF-κB处于沉默状态。LPS等刺激物可以诱导IκBα磷酸化、泛素化以及蛋白酶体降解，从而导致NF-κB/IκB复合物解离。被释放的NF-κB二聚体经过磷酸化后，转移到细胞核中，并参与炎症细胞因子的转录与表达[21]。本试验中，甘草查尔酮A处理细胞后，IκBα、p65蛋白磷酸化受到抑制，表明甘草查尔酮A对于LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞炎性损伤的抑制作用可能与NF-κB信号通路有关。