氟苯尼考纳米晶在鸡体内的药动学

陈胡羚，辛怡霖，侯佳琪，王虹雅，唐 熙，李青云，张 欣，李引乾* (.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 7200;2.四川省北川羌族自治县动物疫病预防控制中心，四川 北川 622750)

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是一种动物专用的酰胺醇类高效广谱抗菌药物，于20世纪80年代后期成功研制，在治疗畜禽细菌性疾病中发挥着重要作用[1-4]。但FFC水溶性极低，在动物体内的吸收不良，生物利用度低，临床上通常以混饲方式给药。当畜禽发病时，通常食欲废绝，导致给药困难，造成药浪费，使用药成本提高，且易对环境造成污染[5]。药物纳米晶体是指将药物颗粒自身纳米化制备得粒径在1～1 000 nm范围内的纳米药物[6-8]。将药物制成纳米晶体，除了可以改善难溶性药物的溶解性[9-10]，增加药物的生物利用度外[11-13]，还具有提高药物疗效，减少使用剂量，降低不良反应等优势[14]，在医药领域纳米晶技术已被广泛应用以提升药物的理化性能。氟苯尼考纳米晶(florfenicol nanocrystal,FFC-NC)相较其原粉有更优的溶解度和其他物理性能，本试验旨在对研制的FFC-NC在鸡体内的药动学进行研究，考察纳米晶对药物生物利用度的影响，以期为FFC-NC的临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂FFC(FB2002051)购自江苏恒盛药业有限公司；FFC标准品(H1715060)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； FFC-NC，本实验室自制；羧甲基纤维素纳(20190712)、肝素钠(20191022)和乙腈(20200309)购自天津市科密欧化学试剂有限公司；醋酸铵(20200508)和甲醇(20200102)购自天津市天力化学试剂有限公司；无水乙醇(200607)购自四川西陇科学有限公司；乙酸乙酯(20200321)购自天津市富宇精细化工有限公司；蛋鸡料购自新希望集团广汉国雄饲料有限公司。

1.2 实验动物600～650日龄健康罗曼粉蛋鸡6只，体质量为(2.3±0.2) kg。饲喂不含任何抗生素及药物的国雄蛋鸡料。饲养环境经过严格消毒，其通风性好，采光好，温度为20～25℃，相对湿度为55%～65%。给药前12 h开始至给药后6 h禁食，自由饮水。

1.3 动物分组及给药方法给药前每只鸡测体质量，并做好标记，抽取0.5 mL血液，置于含肝素钠抗凝剂的离心管中，6 000 r/min离心5 min取上层血浆保存。将FFC原粉和FFC-NC分别用0.2%羧甲基纤维素纳水溶液溶解，配制成FFC质量浓度为10 g/L 混悬液，按20 mg/kg剂量灌胃给药。

试验分为FFC原粉组和FFC-NC组。为了减少干扰变量的影响，两组试验使用同一批健康母鸡6只。适应性饲养2周后，采用交叉试验评价生物利用度。首先以FFC-NC灌胃给药，采血测定其血药浓度。试验母鸡经历3周洗脱后，再以相同剂量灌胃给药FFC原粉。

1.4 血浆样品采集用药后0.083，0.25，0.50，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h分别翅下静脉采血0.5 mL，置于含有肝素钠的离心管中，5 000 r/min离心5 min，取上层血浆，置于-20℃冰箱保存，血浆样品在2周内测完。

1.5 样品处理将血浆样品自然解冻后，混匀，取200 μL血浆，加入400 μL乙酸乙酯以提取FFC。将其涡旋振荡2 min，充分混匀后，8 000 r/min离心2 min，吸取上层乙酸乙酯提取液。按上述步骤，下层液中加入乙酸乙酯重复提取1次，合并2次提取液。45℃氮气吹干，加入200 μL流动相，涡旋振荡3 min后，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品。

1.6 药动学方法学的建立

1.6.1高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)条件 色谱柱采用Shim-pack GIST C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为0.05 mol/L醋酸铵溶液∶乙腈=78∶22(V∶V)，流速：1.0 mL/min，柱温：20℃，紫外检测波长：224 nm，进样量：20 μL。

1.6.2方法专属性 取鸡空白血浆200 μL，按1.5方法处理后，按HPLC法进样20 μL得鸡空白血浆HPLC图谱。取鸡空白血浆200 μL，加入5 mg/L FFC标准液200 μL，按1.5方法处理后，进样20 μL得鸡空白血浆中添加FFC HPLC图谱。将FFC组和FFC-NC组血浆样品HPLC图谱与上述两图谱进行比较分析。

1.6.3标准曲线绘制 于空白血浆中加入FFC标准溶液，配制质量浓度为32 mg/L FFC母液，采用梯度稀释法，将其稀释为16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.1 mg/L，将上述所得不同质量浓度FFC标准血浆样品按1.5项处理后，进行HPLC检测分析。重复测定3次，取平均值。以FFC质量浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制鸡空白血浆中FFC标准曲线，得回归方程。分别按信噪比S/N=3和S/N=10确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.6.4回收率试验 于空白血浆中加入FFC标准液，配制成0.1，4.0，16.0 mg/L低、中、高质量浓度FFC血浆样品，按1.5项方式处理后，进行HPLC检测分析。重复测定3次，计算该质量浓度样品的分析方法回收率和变异系数，计算公式如下：

回收率(%)=A1/A×100%；

1.6.5精密度试验 精密配制0.1，4.0，16.0 mg/L的低、中、高质量浓度的FFC血浆样品，按1.5项方式处理后，进行HPLC检测分析。分别于同日内对每个质量浓度样品测定3次，不同日内连续测定3 d，将测得的色谱峰面积利用标准曲线计算样品质量浓度，将其与加入量比较，计算日内变异系数和日间变异系数。

1.6.6重复性试验 精密配制6份4 mg/L FFC血浆样品，按1.5项方式处理后，进行HPLC检测分析，计算变异系数。

1.7 血药浓度测定对1.5项处理血样所得的供试品，以 HPLC法测定。

1.8 数据处理采用DAS 2.0软件进行数据处理，计算包括药时曲线下面积(AUC)、消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、峰浓度(Cmax)和峰时(tmax)在内的药代动力学参数。最佳房室模型的确定是依据赤池信息准则(akaike information criterion,AIC)值最小原则。利用GraphPad Prism 8.0作图软件绘制药时曲线，利用IBM SPSS Statistics 25.0统计分析软件进行相关药动学参数的差异性分析。此研究采用单因素方差分析法来检验显著性，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 方法专属性该试验采用方法操作便捷，样品处理简单。方法专属性试验结果见图1～4。

图1 鸡空白血浆HPLC图

图2 鸡空白血浆添加FFC HPLC图

图3 FFC原粉组血浆样品HPLC图

图4 FFC-NC组血浆样品HPLC图

对比图1，2可知，色谱图基线平稳，血浆峰与FFC峰分离完全，这说明血浆内源性杂质不会干扰FFC的测定，FFC的保留时间在24 min左右，空白血浆在此处无峰出现。图3为FFC原粉组血浆样品的HPLC图，FFC的保留时间为24.301 min；图4为FFC-NC组血浆样品HPLC图，FFC的保留时间为24.459 min；进一步说明此方法的专属性好，适合用于鸡血浆中FFC检测。

2.2 标准曲线和线性范围以FFC质量浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制鸡空白血浆中FFC标准曲线(图5)。

由图5可得回归方程：y=21 693x+4 720.6，(R2=0.999 2,n=3)。FFC在质量浓度为0.1～32.0 mg/L 具有良好线性关系。按信噪比S/N=3求得鸡血浆中FFC的LOD为0.03 mg/L。按信噪比S/N=10得LOQ为0.1 mg/L。

2.3 回收率利用 HPLC分别对0.1，4.0，16.0 mg/L 低、中、高质量浓度FFC血浆样品进行测定，利用鸡空白血浆中FFC标准曲线回归方程计算回收率，结果见表1。

图5 鸡空白血浆中FFC标准曲线

表1 回收率结果(n=3)

由表1结果可知，各组回收率均高于97%，符合测定要求，说明可采用 HPLC测定鸡血浆样品中FFC考质量浓度。

2.4 精密度利用 HPLC法分别对0.1，4.0，16.0 mg/L 低、中、高质量浓度FFC血浆样品进行日内精密度和日间精密度测定，试验结果见表2。

表2 精密度测定结果(n=3)

表2结果表明，低、中、高3个不同质量浓度FFC血浆样品的日内及日间精密度均小于3.54%，符合测定要求，说明此试验建立的HPLC法可用于测定鸡血浆样品中FFC质量浓度。

2.5 重复性试验对6份4 mg/L的FFC血浆样品进行HPLC检测，结果显示其峰面积为(91 976.83±2 890.475)，平均质量浓度为(4.022±0.132) mg/L，RSD值为3.28%，表明此试验建立的HPLC法的重复性好，检测结果具有可靠性。

2.6 血药浓度测定分别给鸡灌胃FFC原粉和FFC-NC后，两组鸡的不同时间点血药浓度见表3。

表3 FFC 和FFC-NC 组不同时间点血药质量浓度 mg/L

由表3可知，在给药后0.25～6.00 h，FFC-NC组血药质量浓度均高于FFC原粉组，且从6只鸡的最大血药质量浓度可以看出，FFC-NC组要高于FFC原粉组。

2.7 药时曲线及药动学参数

2.7.1药时曲线 分别给母鸡灌胃FFC原粉和FFC-NC后，两组药物在母鸡体内的血药质量浓度-时间曲线如图6。

图6 FFC和FFC-NC组药时曲线图

由图6可以看出，在试验时间范围内，FFC-NC在鸡体内的血药质量浓度明显高于FFC原粉组。FFC-NC组在(0.875±0.137) h时达到最大值，为(8.249±0.713) mg/L，而FFC原粉组在(1.167±0.258) h时达到最大值，为(2.381±0.796) mg/L。

2.7.2药动学参数 采用DAS 2.0药代动力学分析软件和IBM SPSS Statistics 25.0统计学软件对生物利用度试验获得的数据进行处理。根据AIC值最小原则，选择了最佳模型为一室模型(AIC=7.61)，而非二室模型(AIC=16.52)。两组试验所得药动学参数结果见表4。

表4 FFC和FFC-NC组药动学参数

根据表4可得，与FFC原粉组相比，FFC-NC组的达峰时间tmax为(0.875±0.137) h，峰时缩短，药时曲线下面积AUC(0-∞)和峰浓度Cmax分别为(23.957±2.338) mg/(L·h)和(8.249±0.713) mg/L，FFC-NC组的相对生物利用度是FFC组的3.6倍。结果表明，FFC-NC的药动学特征较FFC均有明显改善。

3 讨论

FFC在生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)中属于第Ⅱ类低溶解性、高渗透性药物。FFC极微溶于水，影响其临床使用。将难溶性药物制备成纳米晶，能有效提高其溶解性能，极具发展前景[15]。临床用药可以将药物纳米晶体制成口服制剂、注射制剂、吸入制剂、透皮制剂等多种剂型方便给药[16]。将药物纳米晶体应用于口服制剂，药物的口服药动学特征将得到改善[17]。将纳米晶应用于注射剂，能改善药物的体外溶出率，提高制剂的安全性[18-19]。将纳米晶应用于透皮制剂，药物的溶解性能得到改善，则药物透皮吸收力增强，从而改善药物的药动学特征和生物利用度[20]。

药动学参数是反映药物在体内动态变化规律性的一些常数，是评价兽药质量的重要指标之一。消除半衰期t1/2指血药浓度下降一半所需时间，反映了药物从体内的消除速度，FFC-NC组与原粉组的t1/2无显著性差异，表明将FFC制成纳米晶不影响其在体内的消除速度。药时曲线下面积AUC(0-∞)是血药浓度曲线对时间轴所包围的面积，是评价药物吸收程度的重要指标，FFC-NC组AUC(0-∞)为(23.957±2.338) mg/(L·h)与原粉组AUC(0-∞)(6.749±1.577) mg/(L·h)相比极显著提高(P<0.01)，表明FFC-NC在鸡体内的吸收好。达峰时间tmax反映药物进入体内的速度，达峰时间tmax越短则吸收速度越快，FFC-NC组tmax(0.875±0.137) h与原粉组tmax(1.167±0.258) h相比显著缩短(P<0.05)，表明FFC-NC在鸡体内的吸收速度快。药峰浓度Cmax是给药后血药浓度的最高值，是评价药物吸收速率和吸收程度的重要指标，FFC-NC组Cmax(8.249±0.713) mg/L与原粉组Cmax(2.381±0.796) mg/L相比极显著提高(P<0.01)，表明将FFC制成纳米晶后，其在鸡体内的吸收好且吸收速度快。生物利用度是指药物以一定剂型从给药部位吸收入血的速率和程度，是评价药物质量的重要标准。生物利用度又分为绝对生物利用度和相对生物利用度，绝对生物利用度是内服或其他非血管给药途径所得的AUC与静脉注射的AUC的比值，相对生物利用度则是采用内服参照标准药物的AUC作比较[1]。此试验通过口服给药，比较FFC原粉和FFC-NC在鸡体内的生物利用度。试验结果显示，FFC-NC组的相对生物利用度是FFC原粉组的3.6倍。

SWITALA等[21]研究FFC在火鸡体内的药代动力学，得出在火鸡体内FFC的口服生物利用度为82%。TIKHOMIROV等[22]报道FFC在骡鸭体内的口服生物利用度为73.86%。此外，FFC在肉鸡和犊牛中的口服生物利用度分别为55.3%和88.0%；给猪口服FFC则几乎完全被吸收[23]。鸡静脉注射FFC的半衰期为5.36 h，50%～65%的药物以原形从尿液中排出[1]。以上研究报道FFC在不同动物体内的生物利用度。本试验选择在临床上使用FFC较多的母鸡作为靶动物，采用交叉试验法进行评价，减少了由于机体不同带来的影响。

FFC在兽医临床的使用上受限，主要是其难溶性和生物利用度低的问题。利用纳米技术将难溶性药物制备成纳米晶，增大比表面积，从而增加其溶解度，改善药动学特征和生物利用度[24-25]。此试验利用 HPLC考察FFC和其纳米晶制剂在鸡体内的药动学特征。试验结果显示，FFC-NC组的药动学特征改善明显。说明FFC-NC制剂相较其原粉，具有更优的药动学特征，本试验为FFC-NC的临床使用提供试验依据。