旋毛虫肌幼虫期胞外囊泡对小鼠免疫保护作用

徐枫雁，张媛媛，刘晓雷，刘明远，王学林，王 洋，白 雪 (吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春130062)

旋毛虫病(trichinellosis)是由一种常见的寄生蠕虫，即旋毛虫(Trichinellaspiralis)寄生于人或多种哺乳动物体内引发的严重的食源性人兽共患寄生虫疾病[1]。宿主通常是因为摄食含有旋毛虫的未煮熟或生肉引发感染，该病在人体可以引起不同的症状，从全身发热、腹痛、腹泻、恶心、呕吐、肌肉疼痛到更严重的心肌炎和脑炎，严重时甚至可致人死亡[2]。寄生于动物体内则影响动物自身的生长发育，已经严重威胁到人类健康及牲畜养殖业[3]。近年来，抗旋毛虫感染的候选疫苗抗原主要集中于混合的旋毛虫排泄-分泌(excretory secretory,ES)抗原或单个相对分子质量的重组功能因子，与灭活的全虫疫苗或虫体粗提物以及旋毛虫排泄分泌产物疫苗相比，单一抗原在感染旋毛虫的小鼠体内产生的免疫保护效果通常相对较低[4]。目前，旋毛虫疫苗的研究主要包括灭活疫苗、基因重组蛋白疫苗、亚单位疫苗，合成肽疫苗以及DNA疫苗，这些疫苗均可引起有效的保护性免疫应答[5]。尽管如此，研制抗旋毛虫病新型候选疫苗依旧面临着如旋毛虫生命周期的复杂性，阶段特异性抗原的多样性，免疫逃避以及宿主的免疫调节反应等诸多挑战。

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种可由多种细胞分泌的具有双层磷脂膜结构的囊泡，根据分泌方式可分为微囊泡、外泌体、凋亡小体和迁移体4种[6]。研究发现，多种寄生虫来源的EVs对宿主具有调节宿主免疫应答，提高宿主存活率，增加宿主排虫能力等免疫保护作用，表明完整的寄生虫EVs具备开发疫苗的研究潜力[7-9]。TRELIS等[7]等将棘口吸虫EVs皮下免疫BALB/c小鼠，发现小鼠存活率明显提高，虫卵减少60%，虫体生长发育迟缓，体内IgG和IgM抗体水平升高。SHEARS等[8]使用超速离心法获取鼠鞭虫EVs，随后皮下免疫C57BL/6小鼠发现，小鼠体内产生高水平IgG2a/c，减虫率达60%。KIFLE等[10]对曼氏血吸虫15,120 kDa的EVs进行蛋白质组学分析后发现其中含有多种可作为曼氏血吸虫病候选疫苗的蛋白。

迄今为止，旋毛虫肌幼虫期胞外囊泡(Trichi-nellaspiralismuscle larvae extracellular vesicles,Ts-ML-EVs)对小鼠是否具有免疫保护效果尚未报道。本试验首次以Ts-ML-EVs为研究对象，观察其对感染旋毛虫前后小鼠成虫和肌幼虫减虫率以及体内各抗体水平、细胞因子含量的影响，为旋毛虫有效候选疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫种和实验动物旋毛虫(国际标准虫种编号：ISS534)由本实验室保存。6～8周龄健康雌性BALB/c小鼠，体质量为16～20 g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心。

1.2 主要试剂RPMI1640、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白银染试剂盒、化学发光显影试剂盒均购自中国碧云天生物技术公司；10 kDa超滤管购自美国Millipore公司；小鼠IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、IgG、IgA、IgE、IgM ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；IgG1、IgG2a ELISA检测试剂盒购自美国mnimAbs公司；流式荧光PE-CD63和APC-CD81抗体购自上海优宁维生物科技有限公司；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×)购自鼎国生物技术有限公司；多克隆山羊抗烯醇化酶(Enolase)抗体、单克隆兔抗热休克蛋白70(Hsp70)抗体均购自英国Abcam公司；HRP标记的驴抗山羊IgG抗体购自美国Jackson ImmunoResearch公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG抗体购自美国Cell Signaling公司；IMS1313佐剂感谢法国赛比克公司馈赠。

1.3 旋毛虫肌幼虫期EVs的分离与鉴定取感染旋毛虫35 d以上的Wistar大鼠处死，使用集样消化法获得旋毛虫肌幼虫(Ts-ML)。将Ts-ML放入事先加好2%双抗的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2培养16 h后取出培养上清，通过差速离心法去除培养上清中的虫体及其他杂质，经0.22 μm滤器过滤后，使用10 kDa超滤管超滤浓缩培养上清并不断用PBS置换至无色上清获得Ts-ML-ES。培养基上清经10 kDa超滤管浓缩后利用超速离心法获得Ts-ML-EVs，最后Ts-ML-EVs经透射电子显微镜观察、纳米颗粒追踪分析、流式细胞术标记EVs表面特异蛋白CD63和CD81和Westren blot分析进行鉴定。

1.4 旋毛虫肌幼虫期EVs对小鼠的免疫程序及攻虫试验将32只小鼠随机平均分为4组，具体免疫程序参考文献[11]。将30 μgTs-ML-ES和50 μgTs-ML-EVs分别与佐剂1∶1等体积混匀后皮下多点注入小鼠体内并轻柔注射点防止疫苗漏出导致免疫失败，PBS对照组和佐剂对照组注射等体积的PBS溶液和PBS+佐剂混合物。三免后2周每只小鼠灌胃肌幼虫300条，灌胃后6 d每组随机取2只小鼠处死，获得各组旋毛虫成虫(Ad6)并逐个计数，比较免疫组与对照组Ad6的数量差异。攻虫后35 d，所有小鼠全部处死，计算各免疫组的肌幼虫减虫率。

1.5 样品的采集和预处理小鼠每次免疫前、末次免疫后2周、攻虫前、攻虫后35 d分别眼眶采血。采集的血液37℃放置1 h后再经1 500 r/min离心15 min获得上层透明血清，分装后放置-80℃冰箱保存，用于后续Western blot分析和ELISA检测试验。

1.6 Western blot分析将Ts-ML-EVs和Ts-ML-ES分别定量20 μg，与5×蛋白上样缓冲液均匀混合后电浴10 min，冷却至室温后上样到12% SDS-PAGE凝胶，上层胶电压70 V、30 min，下层胶电压120 V、2 h。结束后切下目的条带，湿转2 h后放入5%脱脂牛奶封闭液中室温摇床封闭2 h。封闭结束后将PVDF膜分别放入加好三免的Ts-ML-EVs小鼠血清(1∶200)，多克隆山羊抗Enolase(1∶200)和单克隆兔抗Hsp70(1∶1 000)的封闭液中，4℃摇床孵育过夜。次日使用TBST洗6遍，每次5 min，然后分别将HRP标记的兔抗鼠IgG(1∶3 000)，驴抗山羊IgG(1∶50 000)和山羊抗兔IgG(1∶2 000)的二抗加入封闭液中，室温摇床孵育2 h，结束后用TBST洗涤6次，每次5 min，最后应用UVP Chemstudio多功能化学发光成像系统拍摄结果并保存。

1.7 免疫小鼠血清抗体和细胞因子检测将收集到的不同天数的血清分组标记好后使用ELISA试剂盒检测抗体IgG、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2a以及细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量，每组设3个重复。酶标仪检测吸光度(D450值)，并按照说明书绘制标准曲线，计算细胞因子浓度。

2 结果

2.1 旋毛虫肌幼虫期EVs的分离、纯化与鉴定透射电子显微镜观察到Ts-ML-EVs呈典型双层磷脂膜囊泡样结构(图1)；纳米颗粒追踪分析结果显示Ts-ML-EVs直径为100～180 nm，峰值为126 nm(图2)，符合寄生虫EVs形态结构特征。通过流式细胞术检测到EVs表面标志物CD63和CD81(图3)；Western blot结果表明，Ts-ML-EVs中含有EVs标志蛋白Enolase和Hsp70(图4)。

2.2 旋毛虫肌幼虫期EVs的SDS-PAGE和Western blot分析SDS-PAGE分析显示Ts-ML-EVs、Ts-ML-ES、Ts-ML-EVs上清的蛋白组分成分均一、稳定无降解，相对分子质量分布于10～190 kDa，其中大部分蛋白条带是各组分所共有的(图5)。但是，与Ts-ML-EVs相比，其他组分存在几条特异性和差异性表达蛋白条带。Ts-ML-ES相对分子质量为40 kDa 的蛋白条带有所增加，Ts-ML-EVs相对分子质量在45～75 kDa之间的蛋白含量更高。经Western blot分析，纯化后的Ts-ML-EVs可被接种3次Ts-ML-EVs后的小鼠血清特异性识别，而与健康小鼠血清呈阴性反应(图6)，证明Ts-ML-EVs有较好的反应原性。

图1 Ts-ML-EVs在透射电子显微镜下的形态

图2 纳米颗粒追踪分析Ts-ML-EVs的粒径大小

图3 流式细胞术检测Ts-ML-EVs表面抗体标志物CD63和CD81

1.虫体蛋白；2.Ts-ML-EVs

2.3 旋毛虫肌幼虫期EVs对小鼠体内各特异性抗体水平影响分析将各组抗原免疫小鼠后，使用ELISA试剂盒检测免疫后各时间段小鼠体内各特异性抗体水平变化趋势。结果表明，与PBS组和佐剂对照组比较，Ts-ML-EVs组在首免和二免后特异

M.预染蛋白Marker；1.Ts-ML-EVs；2.Ts-ML-ES；3.Ts-ML-EVs上清；4.Ts虫体蛋白

M.蛋白Marker；1，3 Ts-ML-ES； 2，4.Ts-ML-EVs； 1，2.健康小鼠血清； 3，4.三免Ts-ML-EVs后的小鼠血清

性IgG水平缓慢升高，三免后抗体水平迅速增加(图7A)，差异极显著(P<0.000 1)，表明Ts-ML-EVs能诱导机体产生一定的体液免疫应答。首免后，试验组IgG1抗体水平迅速上升，直至三免后两抗体水平达到最高(图7C)。一免后，Ts-ML-EVs组IgG2a抗体水平缓慢升高，二免后抗体水平迅速上升，与对照组差异极显著(P<0.000 1)(图7D)，此外IgG1水平高于IgG2a，且差异显著(P<0.05)。说明Ts-ML-EVs能诱导以Th2为主的Th1/Th2混合免疫应答。首免后IgM抗体迅速增加，二免后缓慢增加，达到最高值，三免后抗体水平呈下降趋势(图7B)，表明Ts-ML-EVs能诱导机体产生高水平的IgM抗体。Ts-ML-EVs组经一免、二免后IgA抗体在缓慢上升，三免后显著升高(P<0.01)(图7E)，表明Ts-ML-EVs能诱导机体产生一定水平的IgA抗体。Ts-ML-EVs组一免、二免后IgE抗体迅速增加，三免后Ts-ML-EVs组IgE抗体水平缓慢增加达到最高值(图7F)，表明Ts-ML-EVs能诱导机体产生高水平的IgE抗体。

A.各组小鼠血清中IgG抗体含量变化;B.各组小鼠血清中IgM抗体含量变化;C.各组小鼠血清中IgG1抗体含量变化;D.各组小鼠血清中IgG2a抗体含量变化;E.各组小鼠血清中IgA抗体含量变化;F.各组小鼠血清中IgE抗体含量变化。*示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001；****示P<0.000 1。下同

2.4 旋毛虫肌幼虫期EVs对小鼠体内细胞因子含量影响分析将各组抗原免疫小鼠后，使用ELISA试剂盒检测免疫前后各时间段小鼠体内Th1和Th2型细胞因子的变化趋势。试验结果显示，与PBS组和佐剂对照组相比，一免后其他2组IL-4和IL-10的水平均极显著升高(P<0.01)，并随着免疫次数增加不断上升，三免2周后达到最高(图8A，B)。而IL-12和IFN-γ的水平随着免疫次数增加略有升高(图8C，D)，与Th2型(IL-4、IL-10)细胞因子差异显著(P<0.05)，2组之间无明显差异。PBS和佐剂对照组4种细胞因子均无显著变化。结果表明，Ts-ML-EVs能诱导机体产生细胞免疫应答，且与体液免疫应答结果一致。经过计算后结果显示，Ts-ML-EVs的成虫减虫率为23.4%，肌幼虫减虫率为43.7%(图9)。

A.各组小鼠血清中细胞因子IL-4含量变化；B.各组小鼠血清中IL-10含量变化;C.各组小鼠血清中IL-12含量变化;D.各组小鼠血清中IFN-γ含量变化

图9 各试验组的成虫和肌幼虫减虫率

3 讨论

EVs是直径大小集中在50～250 nm、具有磷脂双分子层椭圆形结构的囊泡[12]。EVs的鉴定方法通常为透射电镜观察、纳米颗粒追踪分析和Western blot等，随着科学技术发展，近年来流式细胞术也越来越多地应用到EVs表面标志蛋白鉴定中，因此运用上述方法对收集到的囊泡进行鉴定。结果证明本试验获得的囊泡呈典型双层囊泡结构，直径为100～180 nm，峰值为126 nm，具有EVs表面标志物CD63和CD81，内含EVs标志蛋白Enolase和Hsp70，符合寄生虫EVs表征，可以用于进一步的免疫保护性试验。

目前已鉴定到寄生虫EVs中包含部分免疫调节分子或与已知免疫调节分子相似的蛋白，除此之外EVs还含有mRNA、miRNA、脂质等物质，在虫体侵袭及与宿主的相互作用过程中发挥重要作用[13-14]。本试验Western blot结果显示，Ts-ML-EVs可识别抗Ts-ML-EVs小鼠免疫血清，具有免疫反应原性，与Ts-ML ES相比多出40～45 kDa条带，表明Ts-ML-EVs可能参与宿主抗旋毛虫感染免疫反应。为了探究Ts-ML-EVs对小鼠免疫保护效果，本试验将Ts-ML-EVs与IMS1313佐剂等体积均匀混合作为疫苗免疫小鼠，发现经过三免后，Ts-ML-EVs的成虫和肌幼虫减虫率分别为23.4%和43.7%。Ts-ML-EVs在Ts-ML-ES中占比极低，但具有很好的免疫原性，表明Ts-ML-EVs起到一定的抗寄生虫作用，是一种很好的抗旋毛虫免疫候选抗原，有利于更加快速筛选免疫调节分子，研制新型候选疫苗。

COAKLEY等[15]利用多形螺旋线虫EVs免疫C57BL/6小鼠，结果减虫率为82%，且小鼠体内存在高滴度的IgM、IgG1和IgA抗体。本试验结果表明，与PBS组和佐剂对照组相比，首次免疫开始后，Ts-ML-EVs免疫组小鼠体内IgG和IgM水平含量即显著上升，并且随着加强免疫的次数持续增加，其中以IgM变化最为明显，首免2周后即可在小鼠体内检测到高滴度抗体，但与其他抗体不同的是，二免2周后抗体水平达到最高值，三免后则开始缓慢下降，IgA和IgE含量也同样升高，但没有其他几种抗体变化差异明显。研究发现IgM是寄生虫感染后获得性免疫最先产生的抗体，激活经典的补体级联反应的能力是IgG的1 000倍，具有加强和促进体液免疫应答的能力，在抵抗蠕虫感染中发挥重要作用，推测IgM可能通过促进IgG的应答间接参与了抗旋毛虫的保护性免疫应答，因此当IgG水平达到一定高度时，IgM则开始逐渐下降[11,16-17]。可能是由于Ts-ML-EVs可以诱导小鼠产生各种高滴度抗体和细胞因子，因此可以通过影响旋毛虫生长发育过程，发挥抵抗虫体侵袭作用。

据报道，Th1型细胞因子具有清除胞内病原体的功能，而Th2型细胞因子可以聚集和激活嗜酸性粒细胞和肥大细胞，从而抵抗寄生虫感染[18]。本试验细胞因子水平变化显示Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-4、IL-10)型免疫反应均增强，其中代表Th2型免疫反应的IL-4和IL-10细胞因子变化较明显，而IL-4在抗旋毛虫感染中发挥重要作用。研究表明，IgG1反映了Th2型免疫反应，IgG2a则反映Th1型免疫反应，同时发现IgG1和IgG2a含量随着免疫次数增加不断上升且IgG1水平高于IgG2a，差异显著(P<0.05)。这2种抗体水平变化与细胞因子含量相符合。

综上所述，本研究首次将Ts-ML-EVs作为疫苗免疫小鼠，发现小鼠体内抗体增加，细胞因子水平变化显示Ts-ML-EVs可引起Th1/Th2型混合免疫反应，且以Th2型免疫反应为主，成虫和肌幼虫减虫率分别为23.4%和43.7%。本试验为筛选有效旋毛虫疫苗抗原及进一步开展相关研究提供理论依据。