P16 在宫颈病变中表达与预后价值的综合分析*

陈 玥，陈 思，王 静，罗 梅，钟伟萍，叶宇齐，曾 铮，荀爱华***

(1 江苏省中西医结合医院妇产科，南京 210028；2 南京中医药大学第三临床医学院)

宫颈癌是目前全球女性因癌症死亡的第四大原因，也是20～39 岁女性因癌症死亡的第二大原因，每年死亡人数超过300 万[1]。随着人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)分型检测技术广泛应用于临床及疫苗接种率的提高，本病的发病率已经逐渐下降[2]。世界上许多国家针对本病已经制定了不同策略的筛查计划，大多数以宫颈细胞学的结果为依据。然而现有证据[3]显示：30%的宫颈癌患者可能至少有一次细胞学的假阴性结果，因此，临床医师需要更加精确的手段以提高疾病筛查率。

基于持续性HPV 感染在宫颈癌发病机制中的重要性，HPV 和细胞学的联合双筛作为疾病的初步筛查方法亦普及于临床。但由于女性一过性HPV 感染的高发病率，造成HPV 分型对于区别诊断低级别和高级别宫颈病变的特异性不强，尤其是在年轻女性中更为多见[4]。临床医师需要一种更好的指标，而免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)是评价疾病严重程度的敏感方法，且特异性更显著[5]。针对HPV感染导致的相关损伤，最常用的IHC 标记是p16[6]。P16 由CDKN2A 基因编码，是一种肿瘤抑制基因，可直接抑制细胞增殖[7]。而在HPV 相关的恶性肿瘤中，p16 过表达导致不能有效抑制被HPV 感染的细胞增殖，其高表达已被认为是诊断HPV 所致宫颈癌的生物标志物。尽管已有研究分析了p16 在宫颈癌发生发展及诊断中的作用，但关于其突变情况、相关生物学功能及免疫细胞浸润对肿瘤的影响仍知之甚少，吸引了学者们的关注。

1 资料与方法

1.1 GEPIA 2 GEPIA 2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)数据库是基于癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库建立的癌症大数据可视化分析平台，它将基因表达定量从基因水平扩展到转录水平，并支持特定癌症亚型的分析和亚型间的比较[8]。“Single Gene Analysis”模块下输入“CDKN2A”，获取p16 在泛癌组织与正常组织中的表达差异。“Expression DIY”模块下分别选择“BoxPlot”、“Stage Plot”，“Cancer name”选择“CESC”(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma,宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌)，其余选项保持默认，分析p16 在宫颈癌组织与正常组织中的差异及其与宫颈恶性肿瘤分期的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2 Kaplan-Meier plotter Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)数据库是一种用于探索54 000 个基因对生存影响的工具，涵盖包括宫颈癌在内的21 种癌症类型[9]。数据来源于宫颈癌患者TCGA 数据集、高通量基因表达(gene expression omnibus,GEO)和欧洲基因组-表型组档案(European Genome-phenome Archive,EGA)数据库下载的基因表达数据、无复发和总生存信息等资料，使用该工具对宫颈癌中p16的不同表达水平进行预后分析。利用“General”、“Boxplot”、“Stageplot”模块分析p16 在人类癌症中的表达及其与宫颈癌肿瘤分期的相关性。选择“mRNA-RNAseq”选项下“start KM plotter for pan-cancer”模块，Gene symbol 输入“CDKN2A”，Survival 分别选择“OS”、“RFS”，肿瘤类型选择“Cervical squamous cell carcinoma(n=304)”，其余选项保持默认，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.3 cBioPortal cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)被用来分析各类型癌症基因组数据集中的基因变异信息[10]，利用该工具分析宫颈癌患者TCGA 数据集中p16 的基因突变频率、位点与类型，同时利用该网站筛选出宫颈癌中p16 的100 个相关基因。选择“Cervix”选项下“Cervical Squamous Cell Carcinoma(TCGA)”数据库，Gene name 输入“CDKN2A”，分别选择“OncoPrint”、“Cancer Types Summary”、“Mutations”和“Co-expression”模块进行统计分析。

1.4 String String(https://string-db.org/)用来建立蛋白质间相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络模型[11]。本研究对p16 的50 个相关蛋白PPI 网络进行可视化：Multiple Proteins 输入获取的100 个基因列表，Organism 选择“Homo sapiens”，“Settings”设置 为：“full STRING network”、“evidence”和“High confidence(0.700)”。

1.5 WebGestalt WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)是基于WEB 的基因集在线分析工具[12]。通过WebGestalt 对p16 相关基因进行基因本体(gene ontology,GO)功能，京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和Reactome通路分析富集分析，GO 富集分析包括生物过程、细胞成分和分子功能，FDR＜0.05 为差异具有统计学意义。具体步骤：“Basic parameters”模块选择“Homo sapiens”、“Overrepresentation Enrichment Analysis(ORA)”，之后在“Gene List”界面上传相关基因列表。“Functional Database”模块中选择“geneontology”-“Biological Process”、“Molecular function”、“Cellular component”进行GO 富集分析，选择“pathway”-“KEGG”+“Reactome”进行通路富集分析。

1.6 TIMER 2.0 Timer 2.0(Tumor Immune Estimation Resource 2.0)用于评估宫颈癌中p16 的表达与不同类型的免疫细胞浸润水平之间的相关性[13]。选择“IMMUNE”模块，Gene Expression 输入“CDKN2A”，Immune Infiltrates 选择“T cell CD4+”、“T cell CD8+”、“B cell”等免疫细胞类型，导出结果中选择CESC 进行统计。

1.7 IHC 染色 回顾2021 年1 月1 日—12 月31日期间在江苏省中西医结合医院因宫颈病变宫颈环形电切术(loop electrosurgical excision procedure,LEEP)的患者，纳入所有通过IHC 检测p16 的表达以明确诊断的病例。由病理医师严格按流程完成染色，根据标准进行结果判读。

2 结果

2.1 p16在宫颈癌中的表达 通过GEPIA 2 数据库比较p16 在泛癌组织与正常组织中的表达水平，可见p16 在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等多器官恶性肿瘤组织中的表达均上调，尤其在CESC(P＜0.05)、卵巢浆液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、子宫癌肉瘤(uterine carcinosarcomas,UCS)等女性生殖系统恶性肿瘤中显著高表达(图1A～C)，但在宫颈癌不同临床分期中的表达并无差异(图1D)。

图1 p16 在不同类型癌症及宫颈癌各临床分期中的差异表达分析

2.2 p16 在宫颈癌预后中的作用分析 预后分析结果显示：无论从中位数(Median)还是上四分位数(Upper quartile)而言，p16 低表达组患者具有更长的总生存期(中位数HR=1.29，上四分位数HR=1.58)，而无复发生存期(中位数HR=0.87，上四分位数HR=0.95)较短，但差异均无统计学意义(P＞0.05)(图2)。结果提示：p16 低表达的宫颈癌患者可能更早地出现肿瘤复发，但总生存期较乐观。

图2 宫颈癌中p16 的不同表达水平与生存期的相关性(Kaplan-Meier plotter)

2.3 p16 在宫颈癌中的遗传学改变 进一步对宫颈癌中p16 基因变异频率、位点和类型进行分析，选择包含297 例宫颈癌样本的TCGA 数据库，库内共包含278 例样本，6 例(2.2%)样本检测到p16 的遗传变异。基因突变全部发生在宫颈鳞状细胞癌样本中，突变位点集中在E88K，主要类型包括错义突变、剪接突变和深度缺失等(图3)。

图3 宫颈癌中p16 的基因突变情况分析(cBioPortal)

2.4 p16 相关基因的功能及通路富集分析 首先，通过cBioPortal 数据库鉴定出宫颈癌中与p16 关系最密切的100 个基因，运用String 数据库匹配到的其中95 个基因构建PPI 网络图(图4)。WebGestalt 对p16 相关基因进行了GO 富集分析，结果显示：p16相关基因功能主要与生物调节、能量代谢、刺激反应等生物过程；在以下细胞成分中高度富集：细胞膜、细胞核、细胞质、膜封闭腔和内膜系统等；分子功能方面：蛋白质结合、离子结合、核酸结合、转移酶活性和酶调节剂活性等被高度富集(图5A)。此外，KEGG和Reactome 分析结果表明：p16 相关基因与质膜内蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)、RHORho 激酶(Rho-associated kinase,ROCK)、生促红素人肝细胞B 受体(ephrin type B receptor,EphB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等通路相关(图5B)。

图4 p16 相关基因蛋白互作网络

图5 p16 相关基因功能及通路富集网络(WebGestalt)

2.5 p16 与肿瘤免疫细胞浸润的相关性分析 使用TIMER 2.0 数据库评估宫颈癌中免疫细胞浸润与p16 之间的相关性，结果显示：p16 与CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、巨噬细胞呈正弱相关，与肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast,CAFs)呈弱负相关，与中性粒细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、单核细胞无明显相关性(图6)。以上数据表明，p16 在不同类型肿瘤免疫细胞浸润的机制中发挥作用各异。

图6 宫颈癌中p16 表达与不同类型免疫细胞浸润的相关性

2.6 p16 免疫组化染色结果分析 共51 例患者符合纳入标准，结果显示：p16 在宫颈高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)病例中阳性表达率为89.19%，而在低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)病例中阳性表达率为14.29%，差异有统计学意义(P<0.01)(表1，图7)。

图7 不同病理类型宫颈组织中p16 的表达(100×)

表1 不同病例类型中p16 表达情况分析

3 讨论

宫颈癌发病具有明显的地域性特点，85%以上的病例发生在低收入和中等收入国家[14]。从癌前病变到恶性肿瘤之间可能有较长的进展期，这为筛查和早期治疗提供了机会。在细胞学检查中诊断为LSIL 或非典型鳞状细胞-不能明确意义的患者通常会接受如阴道镜+活检等检查，以排除更高级别的病变[15]。而研究[16]表明，70%～90%的LSIL 会自发消退，特别是30 岁以下女性。这意味着许多年轻患者的检查是不必要的，如宫颈环形电切术或冷刀锥切术。不同病理医师对同一等级病变的评估并不一致，且单独应用HE 染色的诊断个体差异较大，同时由于宫颈病变细胞学的多样性，最终可能造成误诊和漏诊。

P16 基因由p16INK4a、p15INK4b、p18INK4C 和p19INK4D 组成。P16 可与细胞周期蛋白D1 竞争性结合CDK4，通过抑制CDK4 活性直接参与细胞的生长、增殖，起负调节作用[17-18]。HPV 表达的E7 蛋白干扰成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)基因的正常功能，E7 与磷酸化的Rb(pRb)结合使其功能失活，pRb 对p16 蛋白表达的负反馈抑制消失，导致p16 过表达[19]，最终引起宫颈上皮细胞的细胞周期紊乱，启动一系列癌变过程[20]。目前认为p16 免疫染色阳性可作为HSIL 的诊断标志物，p16 过表达是宫颈高危型HPV 感染的替代指标[21]。

宫颈组织病理学检查易受主观因素影响，特别是在诊断LSIL 时。而p16 过表达几乎存在于所有的HSIL 和宫颈癌组织中，且表达位置有差异：在LSIL组织基底层弥漫表达，而在HSIL 组织的中层和浅层表达。因此，p16 检测对于提高宫颈组织学诊断的正确性和再现性方面有重要意义。在D.ZHANG 等[19]的研究中，p16 阳性与HE 染色病理诊断之间存在很强的一致性，而对于p16 阴性的患者，几乎可以100%排除宫颈HSIL 或浸润癌。A.C.GUEDES 等[22]对90 例宫颈上皮内瘤变患者的病理切片进行了p16 和Ki-67 免疫组化染色，发现其与宫颈上皮内瘤变分级具有非常好的一致性。这些研究也与本结果相符合，生存分析显示：p16 低表达宫颈癌患者的无复发生存期较短，但总生存期更长。一种可能是p16 具有抑制肿瘤的作用，可以特异性地抑制cyclinD/CDK4/6 通路活性，从而调控细胞周期。肿瘤细胞增殖因此受到抑制，表达p16 的肿瘤整体表现出更好的预后。

近年来，研究[23]证实恶性肿瘤的发病与身体的免疫状态密切相关。众所周知，肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的旁分泌，内分泌和细胞间相互作用影响疾病的发展和预后，肿瘤微环境被认为是重要的预后因素[24]。T 淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫机制中起主要作用，主要分为不同的功能亚群：辅助性T 细胞(CD3+CD4+)，细胞毒性T 细胞(CD3+CD8+)，调节性T 细胞(Treg)等。CD8+T 细胞是主要的抗肿瘤效应细胞，CD4+T 细胞促进细胞活化和增殖，两者协同发挥抗肿瘤作用；而Treg 细胞可诱导肿瘤免疫抑制和免疫逃逸[25]。恶性肿瘤患者T 淋巴细胞亚群的数量和功能异常会引起机体免疫系统失调，从而加速肿瘤的进展。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在不同条件下可分化为抗肿瘤经典活化型(M1 型)或替代活化型(M2 型)，而M2 型巨噬细胞数量的增加与肿瘤转移高度相关[26]。CAFs 是活化的成纤维细胞，是部分癌症类型中最丰富的基质成分[27]。CAFs 的异质性使其能对各种微环境信号作出不同反应，并在癌症进展过程中成为干预的对立因素，给恶性肿瘤的临床治疗提出了重大挑战。然而，专注于分析受各种癌症类型中不同CAFs 亚型影响的研究是有限的。CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和巨噬细胞被认为能通过免疫反应实现抑癌作用，然而免疫逃逸机制或许是造成免疫细胞大量浸润而不能发挥抗肿瘤作用的罪魁祸首，与之相关的研究亟待进一步深入。

目前p16 染色已在部分医院展开应用，旨在进一步区分宫颈病变的级别。而推广开发p16 快检试剂盒可能更有利于在体检人群中精确地发现患病人群，尤其是罹患高级别病变者。本文使用公共数据库通过生信分析证实p16 在宫颈病变中呈高表达，并导致免疫细胞浸润比例失调。针对发现的异常免疫细胞分群浸润，寻求采用更有效免疫干预措施或许会使宫颈癌患者受益，如对免疫治疗的应答、延长生存期等。预后分析则提示：选择p16 作为分流指标可以提高筛查的准确性并实现更个体化的随访复查策略，避免年轻女性的过度检查；特别是对于中低收入国家而言，其经济效益和社会效益更为可观，今后还需要进一步开展更大样本的多中心实验加以证实。